不同运动方式对肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α/FNDC5/ PPARγ信号通路的影响

2019-04-08徐晓阳

体育科学 2019年3期

邓红，徐晓阳，张卫

（1．华南师范大学体育科学学院，广东广州510631；2．广州体育职业技术学院，广东广州510650）

过氧化物酶体增殖物激活受体 γ辅助活化因子-1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）是与机体能量代谢关系较为密切的转录辅助激活因子，主要表达于富含线粒体的组织中，如骨骼肌、棕色脂肪、肝脏等。它与运动引起的一系列适应性变化，如线粒体生物发生、肌纤维类型转化、能量代谢、血管生成等密切相关（Chinsomboon et al.,2013; Handschin et al.,2008b;Narkar et al.,2011; Stine et al.,2009），是运动防治代谢性疾病的主要靶点之一（Baar et al.,2002; Yan,2009）。已有研究表明，长期有氧运动和急性运动都可以增加骨骼肌 PGC-1α 的表达（Norheim et al.,2014;Ropelle et al.,2009）。鸢尾素（Irisin）（Bostrom et al.,2012）是 PGC-1α依赖性肌肉因子，Handschin（2007a）研究发现，运动首先诱导骨骼肌表达 PGC-1α，PGC-1α进而促进 FNDC5的表达，FNDC5被蛋白酶切生成一种新的形式——Irisin，Irisin从骨骼肌合成分泌后，进入血液循环作用于白色脂肪细胞，使其转变为棕色脂肪细胞，从而发挥减肥作用。多项研究指出，Irisin可以解释运动引起的适应性变化，是运动减肥及防治代谢性疾病的新靶点（Kelly et al.,2012; Timmons et al.,2012;Villarroya,2012）。而 PPARγ是调控糖脂代谢的重要核受体，是FNDC5信号通路的下游靶蛋白之一，在机体肥胖中发挥着重要的作用（Guan et al.,2002）。

目前，长期有氧运动提升高脂膳食小鼠以及大鼠骨骼肌中的 PGC-1α，继而促进脂肪酸的有氧氧化已被众多研究证实（苏坤霞,2019; Yuan et al.,2014）。并且有研究认为，有氧运动引起大鼠骨骼肌 PGC-1α的变化跟运动强度关系密切（许杰等,2018）。随着运动增进健康的研究深入，抗阻运动的控体重以及减脂效果也被越来越多的人认可（高艳敏等,2017），但是抗阻运动以及抗阻运动与有氧运动相结合对肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信号通路的调控尚不清楚。本研究通过高脂膳食诱导造成大鼠肥胖模型，并进行抗阻运动、有氧运动以及抗阻运动与有氧运动相结合干预，观察不同运动方式对肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ转录与翻译水平的影响，进一步探讨 PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ在多种运动方式相结合中降体重和减脂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SD雄性健康大鼠，由中山医科大学动物研究中心提供。分笼饲养，自然光照，自由摄食和饮水。

1.2 主要仪器设备与试剂

实时荧光定量 PCR仪（BIO-RAD）、微量分光光度计K2800（北京凯奥科技有限公司）、垂直电泳仪及转移系统（BIO-RAD）。此外提取组织RNA及PCR的相关试剂均购自TAKARA公司。

主要抗体包括抗 PGC-1α（CST）、FNDC5（CST）、PPARγ（CST）、β-actin抗体（杭州贤至），以及羊抗兔IgG-HRP（博士德），羊抗小鼠 IgG-HRP（博士德）等。PVDF膜（BIO RAD），蛋白提取液（碧云天生物）。

1.3 实验分组与肥胖造模

大鼠适应性喂养 1周后，随机分为正常对照组（CON组，8只，喂普通饲料）和肥胖造模组（60只，喂高脂饲料）（朱惠莲等,2002），所有饲料混匀后加适量水压成条状，烘干即成。每天定时记录大鼠的体重、摄食量和饮水量，喂养12周后挑选体重超过正常组大鼠10%的大鼠作为造模成功大鼠（陈佳红等,2006; Wood et al.,2003）。从造模成功大鼠中随机选取32只分为肥胖对照组（OC组）、肥胖有氧运动组（OAE组）、肥胖抗阻运动组（ORE组）、肥胖抗阻运动+有氧运动组（OARE组），每组 8只，喂普通饲料，进行后续实验方案。

1.4 运动方案

有氧运动组：采用 BCPT-98型动物跑台，坡度为 0，跑台速度0～100 m/min可任意调节，运动采用循序渐进的方式，适应性运动 1周，然后逐渐增加运动时间和运动速度，最大运动速度定于20 m/min，运动30 min休息1 min，共运动60 min，隔天运动，共运动12周。

抗阻运动组：大鼠抗阻运动采用尾部负重爬梯的方式（Lee et al.,2004），负重的重量以大鼠体重的20%为起点，每周以大鼠体重 20%的重量递增，根据大鼠的实际情况，大鼠最终的负重总量为大鼠体重的100%。每次运动6组，每组爬梯6次，组间休息30 s，爬完3组休息2 min，再进行另外3组运动，隔天运动，共运动12周。

抗阻运动+有氧运动组：抗阻运动和有氧运动交替进行，具体运动强度和运动时间跟单一运动一样。

1.5 取材

在第 12周末次运动后 24 h左右进行采样，采样前对所有大鼠禁食过夜。腹腔注射水合氯醛（10%）麻醉实验大鼠，腹主动脉取血，迅速剥离腓肠肌、肾周脂肪垫和附睾脂肪垫等待测组织并称重，迅速放入液氮罐速冻，然后将样品转移到-80℃冰箱保存备用。

1.6 大鼠体脂率的计算

体脂率=（左右肾周脂肪+左右附睾脂肪）/体重×100%（朱小烽等,2017）45。

1.7 腓肠肌PGC-1α、FNDC5及PPARγ mRNA表达量的测定

采用Trizol 提取腓肠肌总RNA，测量总RNA的浓度。经逆转录反应后合成 cDNA，实时荧光定量 PCR 法测定PGC-1α、FNDC5及 PPARγ的 mRNA 表达量。以 β-actin为内参，RQmin、Rqmax及Ct值由软件自动分析得出，采用 2-△△Ct进行相关定量。利用 NCBIPrimer-BLAST功能设计相关引物，实验所需引物序列见表1。

表1 基因上下游引物序列Table 1 Primer Sequences of Target Genes

1.8 腓肠肌PGC-1α、FNDC5及PPARγ蛋白的测定

将液氮中保存的大鼠腓肠肌组织于冰上加入 RIPA 裂解液研磨，提取组织蛋白，离心获取上清后进行BCA法蛋白定量，将定量裂解后的样品取 100 ul加入 5X蛋白上样缓冲液25 ul混匀。煮沸处理15 min，冷却后待用。电泳时总上样量为 50 ug总蛋白。根据目的蛋白的分子量制胶，常规上样、电泳、转膜。转膜后将膜完全浸没于 5%的脱脂奶粉中，水平摇床室温孵育2 h进行封闭。用5%BSA-TBST稀释一抗（PGC-1α 1:1 500，FNDC5：1:500，PPARγ：1:500，内参抗体 β-actin 1:1 000），4℃水平摇床孵育过夜。次日，TBST洗膜5次后，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h（1:2 500）。TBST洗膜5次后ECL显影，胶片曝光。使用 ImageJ软件分析各个条带的灰度值，进行统计分析。

1.9 统计方法

实验数据用SPSS 20.0软件数据包处理，各数据用平均数±标准差（M±SD）表示。多组间比较采用 One-way ANOVA中的两两比较（LSD检验），显著性水平均为P＜0.05，相关性分析采用双变量相关性分析，以 P＜0.05和P＜0.01定为差异显著性水平的界值。

2 研究结果

2.1 抗阻运动、有氧运动以及抗阻运动与有氧运动相结合对肥胖大鼠体重、体脂率的影响

表 2的结果显示，大鼠造模前组间没有显著性差异，造模成功后，肥胖各组大鼠体重组间没有差异，但都显著高于正常对照组组（P＜0.05），并且造模组大鼠的体重高于对照组10%以上；经过12周的运动干预后，肥胖抗阻运动组、肥胖有氧运动组、肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠的体重都显著低于肥胖对照组（P＜0.05），并且肥胖有氧运动组和肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠的体重显著低于肥胖抗阻运动组（P＜0.05）；肥胖有氧运动组大鼠的体脂率显著低于肥胖对照组（P＜0.05），肥胖抗阻运动组以及肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠的体脂率低于肥胖对照组，高于肥胖有氧运动组，但都没有显著性差异（P＞0.05）。

2.2 不同运动方式对肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表达量的影响

图 1的结果显示，正常对照组、肥胖有氧运动组、肥胖抗阻运动组以及肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表达量都显著高于肥胖对照组（P＜0.05）；肥胖有氧运动组大鼠骨骼肌 PGC-1α的mRNA和蛋白表达量显著高于肥胖抗阻运动组和肥胖抗阻运动+有氧运动组（P＜0.05），肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表达量显著高于肥胖抗阻运动组（P＜0.05）。

图1 不同组大鼠骨骼肌PGC-1α的mRNA和蛋白的相对表达量比较Figure 1. Comparisons of Relative Expression Levels of PGC-1α mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups

表2 不同组大鼠体重、体脂率的比较Table 2 Comparisons of Body Weight and Body Fat Percentage among Different Groups

2.3 不同运动方式对肥胖大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白表达量的影响

如图2所示，正常对照组、肥胖有氧运动组、肥胖抗阻运动组以及肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表达量都显著高于肥胖对照组（P＜0.05）；肥胖有氧运动组大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组和肥胖抗阻运动+有氧运动组（P＜0.05）。肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组（P＜0.05）。

图2 不同组大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白表达量的比较Figure 2. Comparisons of Relative Expression Levels of FNDC5 mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups注：n=8，“*”表示与正常对照组组相比，P＜0.05；“#”表示与OC组相比，P＜0.05；“▲”表示与 OAE组相比，P＜0.05；“&”表示与ORE组相比，P＜0.05。

2.4 不同运动方式对肥胖大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白表达量的影响

如图3所示，正常对照组、肥胖有氧运动组、肥胖抗阻运动组以及肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌 PPARγ的mRNA和蛋白的表达量都显著高于肥胖对照组（P＜0.05）；肥胖有氧运动组大鼠骨骼肌 PPARγ的 mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组和肥胖抗阻运动+有氧运动组（P＜0.05），肥胖抗阻运动+有氧运动组大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组（P＜0.05）。

图3 不同组大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白表达量的比较Figure 3. Comparisons of Relative Expression Levels of PPARγ mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups注：n=8，“*”表示与正常对照组组相比，P＜0.05；“#”表示与 OC组相比，P＜0.05；“▲”表示与 OAE组相比，P＜0.05；“&”表示与ORE组相比，P＜0.05。

2.5 PGC-1α、PPARγ及 FNDC5基因及蛋白表达量与大鼠体重、体脂重量、体脂百分比的相关性分析

表 3的结果显示，大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5及PPARγ的mRNA及蛋白表达量与大鼠体重、体脂重量、体脂百分比呈负相关，且都具有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 PGC-1α、FNDC5及PPARγ的mRNA和蛋白表达量与大鼠体重、体脂重量、体脂百分比的相关性分析Table 3 The Correlation between mRNA and Protein Expression Levels of PGC-1α, FNDC5,and PPARγ with the Body Weight, Body Fat Weight and Body Fat Percentage

3 讨论与分析

肥胖是严重危害人类健康的现代病症，可导致众多的并发症，比如高血压、高血脂、糖尿病和肿瘤等，如何防治肥胖已成为人们关注和研究的重点。现今认为，将饮食控制、运动疗法、行为疗法三者有机结合起来是治疗肥胖的较好方法。然而运动控制肥胖的机制，目前尚不完全清楚。

传统的观点认为，运动减肥宜采取中低强度、长时间的持续有氧运动锻炼。但大多数肥胖人群由于体重过大，对长时间中低强度运动难以坚持，因此，从时间效益角度考虑，中低强度长时间持续运动的减肥方式效果欠佳。相关研究表明，一定负荷的抗阻力训练可以改变身体脂肪组织和肌肉组织的平衡关系，增加人体肌肉的重量，而肌肉含量的增加会增加机体的基础代谢率，从而达到减脂的目的（Kraemer et al.,1999; Schmitz et al.,2003; Shaw et al.,2006）。并且抗阻运动持续时间短、运动带来的愉悦感强，对于肥胖患者来说，更容易接受和耐受（王京京,2013; Ohawara et al.,2007）。本研究发现，在减体重方面，抗阻运动和有氧运动，以及两者相结合效果都比较明显，其中效果最好的是抗阻运动与有氧运动相结合的方式。在降体脂率方面，虽然本研究所采用的单纯抗阻运动以及抗阻运动与有氧运动相结合的减脂效果，没有有氧运动效果好，但从时间效应上来说，这两种运动方式所耗费的时间远远短于单纯有氧运动的时间。结果提示，抗阻运动的减脂效果可能与运动强度等参数密切相关，后续应该对不同强度以及不同持续时间的抗阻运动与减脂的效益关系，进行进一步的研究。

PGC-1α是与机体能量代谢关系密切的转录辅助激活因子，研究发现，PGC-1α缺乏可抑制棕色脂肪产热相关基因表达（Uldry et al.,2006）。长期有氧运动和急性运动都可以增加骨骼肌PGC-1α的表达（朱小烽等,2017; Norheim et al.,2014; Ropelle et al.,2009; Yuan et al.,2014）。我们的研究也证实了这一现象。与正常对照组相比，肥胖组大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白的表达都显著低于正常对照组大鼠，而经过 12周的运动干预后，肥胖有氧运动组 PGC-1α的 mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖对照组，并且PGC-1α的 mRNA与蛋白表达量与大鼠的体重、体脂重量、体脂百分比呈非常显著负相关。

虽然已有研究证实，抗阻训练同耐力运动一样，具有促进机体能量代谢的积极效应，但抗阻训练对于 PGC-1α机制是否也同样有效，目前研究报道比较少，而且关于抗阻运动与有氧运动相结合对PGC-1α的影响，尚未见报道。李鹏飞等（2017）研究发现，8周的爬梯负重训练后大鼠趾长伸肌 PGC-1α表达显著增加，而比目鱼肌 PGC-1α表达则显著降低，他们认为，抗阻训练对比目鱼肌和趾长伸肌产生的不同作用可能与快、慢肌纤维构成有关。

运动可以引起骨骼肌PGC-1α表达增加，PGC-1α可以诱导 FNDC5表达升高，FNDC5是一种分泌性蛋白，在骨骼肌合成后经蛋白酶剪切修饰产生一种新的激素 Irisin。该激素可作为骨骼肌与外周组织或器官之间的信使分子，作用于白色脂肪并上调 UCP1的表达，促进皮下白色脂肪向棕色脂肪转化（Bostrom et al.,2012），提高能量消耗，减轻体重，改善糖代谢，进而达到减肥的目的。很多学者（Roberts et al.,2013; Spiegelman et al.,2012; Zadegan et al.,2015）研究发现，Irisin依赖于 PGC-1α而发挥作用，不同运动可以促进高脂喂养肥胖鼠类血浆Irisin和肌肉FNDC5的 mRNA表达水平提升（Chen et al.,2015; Lu et al.,2016;Wrann et al.,2013）。

PPARγ是调控 UCP1等棕色脂肪基因表达的重要核受体，是FNDC5信号通路的下游靶蛋白之一，在脂肪代谢、能量平衡等中起到重要的调节作用（Guan et al.,2002; Rosen et al.,1999）。较多研究发现，运动可以诱导骨骼肌 PGC-1α的高表达，进而激活PPAR。朱小烽等（2017）48等研究发现，小鼠骨骼肌PPARβ与PPARγ在中等强度运动与大强度运动后都有显著性增加，但是在小强度运动后没有显著性变化，他们认为运动强度可能是导致这一现象的关键因素。

本研究发现，肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5以及PPARγ的表达水平均有所下降，而抗阻运动、有氧运动以及抗阻运动与有氧运动相结合这 3种运动方式都能上调其表达，并且大鼠骨骼肌PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ的表达量与大鼠的体重、体脂重量、体脂百分比呈非常显著负相关。这些发现表明，抗阻运动、有氧运动以及抗阻运动与有氧运动相结合可以通过 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信号通路调节控制体重和减少体脂，其具体机制可能是由于高脂膳食降低了大鼠骨骼肌PGC-1α的含量，PGC-1α缺乏不仅可抑制棕色脂肪产热相关基因表达，还会下调骨骼肌FNDC5的表达，导致进入血液的 Irisin含量降低，下游靶蛋白PPARγ的表达减少，最终导致UCP1等棕色脂肪基因表达的减少，减少了能量消耗，从而导致大鼠体重、体脂增加。而经过 12周的抗阻运动、有氧运动以及抗阻运动与有氧运动相结合，刺激了骨骼肌PGC-1α表达增加，PGC-1α刺激骨骼肌分泌Irisin，Irisin进入血液促进白色脂肪转化为棕色脂肪，提高了能量消耗，进而达到减肥的目的。并且我们的研究还发现，肥胖有氧运动组大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5、PPARγ的mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组和肥胖抗阻运动与有氧运动相结合组，肥胖抗阻运动与有氧运动相结合组骨骼肌PGC-1α、FNDC5、PPARγ的 mRNA和蛋白的表达量显著高于肥胖抗阻运动组。这说明在调控 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信号通路方面，本研究所采用的几种运动方式中，有氧运动的效果明显好于抗阻运动以及抗阻运动和有氧运动相结合的方式，而有氧运动和抗阻运动相结合效果好于单纯的抗阻运动，这可能与运动方式本身有关系，也可能与抗阻运动的运动强度有一定的关系。许杰等（2018）的研究已经证实，肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α的表达与耐力运动的运动强度密切相关，而关于抗阻运动的运动强度等参数与 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信号通路的关系，还有待进一步探索。本研究在确定抗阻运动强度时，考虑到肥胖大鼠本身体重比较重，为了安全起见并根据大鼠的实际运动情况，最终采用递增负荷抗阻运动，大鼠尾部最终负重的强度达到大鼠总体重的100%，与王静等（2011）的研究大鼠负重达到 200%还有一定的差距。但本研究所使用的抗阻运动，时间跟有氧运动相比时间明显缩短，对运动减肥及防治代谢性疾病的相关靶点PGC-1α、FNDC5、PPARγ的 mRNA 和蛋白的影响显著，对大鼠的体重、体脂、体脂百分比等肥胖相关指标的影响也比较显著，减肥效果明显。