芪榆膏纱条外敷对肛瘘切除术后创面PCNA表达的影响

曹 波，卢 丹，李 志，刘 访，董聿锟，夏佳毅

（1.贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550001；2.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550001）

目前肛瘘的主要治疗方法仍是以手术为主，手术有切除、挂线等方法[1]。肛瘘术后换药均存在一定的难度，而对于该类伤口的处理，关键在于防止创面基底过早愈合或形成假愈合，故不仅应保证在换药时充分暴露创面、及时清除引流出的分泌物，而且还需在创面基底部填塞纱条，使创面不至过早粘合而形成桥型愈合。因此，创面愈合的快慢取决于肛瘘术后换药方法及所用药物的功效，治疗的关键环节在于肛瘘术后创面的换药。本研究观察了芪榆膏纱条对肛瘘术后创面的影响，报道如下。

1 临床资料

共60例，均为贵州省肛肠病医院接受常规低位单纯性肛瘘切除术治疗的住院患者，随机分成治疗组和对照组各30例。治疗组男27例，女3例；年龄22～62岁，平均（36.63±11.04）岁；平均病程（17.93±5.17）天，创面纵径（4.07±0.66）cm，原始创面面积（35.88±6.6）mm2。对照组男27例，女3例；年龄19～54岁，平均（37.73±12.69）岁；平均病程（19.77±7.18）天，创面纵径（4.1±0.61）cm，原始创面面积（36.33±6.03）mm2。两组性别、年龄、病程、创面纵径、原始创面面积比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

诊断标准：临床诊断标准参照经2006年珠海中华中医药学会肛肠分会、中华医学会外科学分会结直肠肛门外科学组、中国中西医结合学会大肠肛门病专业委员会制定的《肛瘘临床诊治指南》，即肛瘘系肛周皮肤与肛管直肠之间的慢性、病理性管道，常于肛门直肠周围脓肿破溃或切开引流后形成，病灶有外口、管道、内口可征，其中低位单纯性肛瘘诊断标准为：内口在肛隐窝，仅仅只有1个瘘道走行于外括约肌皮下部或浅部并与皮肤相通。

2 治疗方法

芪榆膏纱条的制作：黄芪120g、当归尾60g、生地榆60g、乳没各30g、龙血竭30g、紫草30g、川牛膝30g，各药均匀混合并研成细粉，过筛100目，将药粉纳入1000g麻油中浸泡72h，大火烧开麻油后改用文火将各药炸至药渣呈棕褐色为度，双层纱布滤渣，待油温降至50℃时，将蜂胶徐徐搅拌均匀备用。换药时将芪榆膏均匀涂抹在约5cm×3cm无菌纱条上，厚约1mm。

人工愈合膜纱条制作：换药时将人工愈合膜（杭州积好脂质体有限公司生产）均匀涂抹在约5cm×3cm无菌纱条上，厚约1mm。

两组术前均备皮、清洁灌肠；手术麻醉方式采用连续硬膜外阻滞麻醉；手术方式均采用肛瘘切除术。用尺子分别测量低位单纯性肛瘘术后创面的纵径，选择手术创面纵径为2～5cm之间的肛瘘纳入。术后两组均使用同种抗生素、止痛药、止血药各3天，其中抗生素用奥硝唑0.5g，静滴，日2次；止痛药用氯诺西康8mg，静滴，日2次；止血药用氨甲环酸0.5g，静滴，日2次。

一般肛瘘术后控制大便24h。24h内排大便者便后换药，无便意者24h后换药。两组换药时应充分暴露创面，常规消毒创面及周围皮肤黏膜，仔细清除创面上的坏死组织及液化物，再予无菌干棉球擦掉。治疗组、对照组分别将芪榆膏纱条、人工愈合膜纱条均匀填塞至于创面基底部，填塞纱条长于创面1cm，使之成为口宽底小之形，以无菌纱布敷盖，并予胶布固定。两组均每日换药1次。

3 观察指标

检测术后创面面积及创面愈合率。创面面积：根据孙彦辉等[2]测量创面愈合率的方法，在固定距离15 cm背景上放置1枚1角硬币（面积为2.83㎝²）并进行拍照。于术后第7天及第14天换药前分别用透明薄膜覆盖于创面上，沿创缘描计创面的大小，取下透明薄膜并展开，用数码相机（Nikon D7000、169万像素）于固定距离15cm进行拍照。采用Photoshop图像处理软件，打开使用数码相机拍摄并标记的创面图片，用软件中“魔棒”或者“磁性套索”工具选取图片中所标记的创面部分，打开菜单中的“图像”并选取“直方图”选项，记录显示参数中的“像素”数值。并用同样的方法测量出1角硬币的像素值，1cm2的像素值=1角硬币的像素值/2.83。由上述操作即可计算出创面面积（㎝²）=标记的创面部分像素值/1cm2的像素值。（手术完毕后所测得创面面积作为原始面积）。

创面愈合率：用药第6、13天后（即分别为术后第7、14天）观测评定创面愈合率。参照下列公式[2]：第n天创面愈合率=[（原始创面面积-术后第n天创面面积）/原始创面面积]×100%。

检测PCNA表达：组织标本采集及制备方法[3]。术后第7、14天换药时，在同一时段使用镊子刮取创面边缘约1.0mm×1.0mm的创面组织，放入事先准备好装有一定量的PBS，PH7.4的专用Eppendof管中，注意无菌操作，并做好编号，放于4℃恒温冰箱中保存，立即送往-80℃液氮冰箱中速冻。待60例标本全部收集完毕后全部取出。标本融化后仍然保持2℃～8℃的温度，加入一定量的PBS（PH7.4）。用匀浆器将标本匀浆化，离心20min左右（2000～3000转/min），离心去除沉淀，仔细收集上清，行ELISA法测PCNA的表达。

用SPSS21.0统计学软件处理分析，计量资料以（±s）表示，用t检验，计数资料以（%）表示、用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

4 治疗结果

两组不同时间点创面面积比较见表1。

表1 两组不同时间点创面面积比较 （mm2，±s）

表1 两组不同时间点创面面积比较 （mm2，±s）

指标 治疗组 对照组 t P术后第7天创面面积 13.32±2.17 16.23±2.55 -4.763 0.000术后第14天创面面积 5.53±1.26 8.89±1.85 -8.231 0.000

两组不同时间点创面愈合率比较见表2。

表2 两组不同时间点创面愈合率比较情况 （%，±s）

表2 两组不同时间点创面愈合率比较情况 （%，±s）

指标 治疗组 对照组 t P术后第7天创面愈合率 63.26±2.0954.48±2.27 15.595 0.000术后第14天创面愈合率 84.74±2.5275.25±1.8 16.800 0.000

两组不同时间点创面PCNA表达比较见表3。

表3 两组两组不同时间点PCNA表达比较 （数量每/视野，±s）

表3 两组两组不同时间点PCNA表达比较 （数量每/视野，±s）

指标 治疗组 对照组 t P术后第7天PCNA含量 3.54±0.08 2.94±0.06 -2.532 0.000术后第14天PCNA含量 2.74±0.09 2.40±0.09 -3.735 0.000

5 讨 论

中医认为，肛瘘术后创伤是由于金刃所伤，虽原病灶已除，但肌肤受损、脉络断裂，致使经络损伤，经络阻滞，气血运行不畅，气血凝聚；气血不能传输于肌肤、腠理，故使得术后创面失于荣养，创面缠绵难愈或愈后容易复发。伤前虽无阴阳偏性，但长时间损其正气，外邪可乘伤而入，正虚邪盛，不能托毒外出。虽手术能祛除肛瘘之腐肉，但仍会有部分残留，加之漏疮绵延不愈，术中受金创，久病必虚、久病必瘀，正虚邪盛，不能托毒外出。因此，肛瘘术后创面处于“虚”、“瘀”、“腐”、“湿热”的状态，通过术后换药解决创面的“虚”、“瘀”、“腐”、“湿热”问题尤为重要。肛瘘术后的主要病机是“气血亏虚、湿毒蕴结”虚实夹杂之症，以气血亏虚为主，故治宜益气活血、祛腐生肌为法。

现代医学研究认为，创面愈合的过程需要经历3个基本的阶段：炎症反应期、细胞增殖期以及基质重建期[4]，这3个阶段将影响到创面的愈合时间及愈合质量[4]。①炎性反应期：此期是创伤愈合的初级阶段，包括血小板凝集、纤维蛋白溶解、免疫应答反应和复杂的细胞反应，同时还大量的释放在创面愈合过程中起重要作用的生长因子。②细胞增殖期：实现受损组织的修护是通过细胞（主要有上皮细胞和成纤维细胞等）的迁徙、分化及增殖而实现的。肉芽组织在创面修护中具有非常重要的作用，并为上皮组织爬生提供必要的条件。③基质重建期：此期成纤维细胞减少，肉芽组织生成停止并开始退化，局部组织改构和重塑，使其转变为正常结缔组织以形成瘢痕愈合并逐步恢复功能。

增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）被认定为是DNA聚合酶pol δ（polymerase δ）的一种辅助蛋白，与真核细胞S期的DNA的复制有关[5]。当处于静止期的细胞内时含量较低，而在细胞分裂周期G1晚期时，其含量逐渐增加，其中S期的含量达到高峰，到达G2、M期后，其含量就明显降低[6]。研究表明，PCNA不仅可参与DNA的合成与复制，而且还能够与多种DNA修复因子（如XPG、核酸内切酶等）相互作用，影响核苷酸切除修复（Nucleotide excision repair，NER）和错配修复（mismatch repair，MMR）[7]。PCNA还与PZI和Gadd45蛋白相结合，直接参与调控DNA的修复[8]，因此，PCNA高表达可能一方面跟细胞内的DNA快速合成复制、细胞迅速分裂有关；另一方面可确保细胞在迅速增殖分化时能将正确的遗传信息传递给子细胞，不发生遗传信息丢失或突变的可能，故在DNA合成复制时能对基因组的稳定性和完整性起到保护与监督作用。组织损伤后，创面都需经过炎症反应期、细胞增殖期和基质重建期，如果其中某个环节出现问题将会引起创面愈合失控，从而导致创面过度增生，形成增生性瘢痕，或创面愈合迟缓，形成慢性难愈性溃疡。细胞的增殖和凋亡直接参与和调控创面愈合过程中的多个环节并在影响创面预后的方面起主导作用。创面愈合迟缓的主因可能与由于某些活性修护细胞增殖不足或凋亡过度有关[9]。邢捷等[10]研究补益气血中药八珍汤对大鼠慢性难愈性创面的研究证实：一方面能明显增加创面肉芽组织中PCNA的表达量，促进细胞增殖；另一方面，还能明显抑制创面肉芽组织细胞的凋亡，从而加速创面愈合，缩短创面愈合的时间。

研究结果显示，芪榆膏纱条组能使创面在愈合中期增加PCNA表达并使其达到高峰，从而加速创面愈合；而在愈合晚期PCNA表达减少有益于减少创面瘢痕的形成，缩小创面面积，增加其创面愈合率，从而使创面愈合的速度及质量发生显著变化，加速创面修复的进程。可见芪榆膏纱条影响创面愈合的机制之一是通过PCNA表达而实现的。