外源脯氨酸对盐胁迫下萝卜幼苗生长、抗氧化酶活性及渗透调节物质积累的影响

王 玮,吴传万,王 欣,赵建锋*,汪国莲,孙玉东

(1.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏 淮安 223001; 2.淮阴师范学院 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室,江苏 淮安 223300)

土壤盐渍化(soil salinization)是指土壤中的易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程,也称盐碱化。近几十年来,随着人类对土地的过度开垦,化肥、农药的过量使用,耕地休耕制度执行不到位,土壤盐渍化现象越来越成为一个全球性的问题。盐害已成为影响作物生长和作物产量的主要因素,可以导致作物平均单位面积产量降低50%以上[1-2]。目前,全球盐碱土壤面积约为9.6亿hm2,占灌溉农田的1/3,我国约有1亿hm2,主要分布在西北、华北、东北和滨海地区[3]。在我国,随着设施大棚面积的逐年增长、化肥的过量使用,设施农业的土壤次生盐渍化现象也越来越突出,严重制约了农业生产。

在盐胁迫条件下,大部分植物会表现出一系列的生理生化反应失调[4]。现有研究表明,盐胁迫会抑制植物的光合作用，造成生理代谢失调，引起植物的氧化胁迫和离子毒害，抑制植物的生长发育,甚至导致死亡。同时,在盐胁迫下,植物通过对矿质离子的选择性吸收、提高细胞渗透调节能力、提高离子区域化水平和活性氧清除机制来提高植物本身对盐胁迫的耐受性[5-8]。

萝卜是我国重要的蔬菜作物,在全国各地均有栽培[9]。盐害等逆境胁迫已成为我国萝卜减产的主要原因之一,而在盐胁迫下萝卜生长发育及相关生理响应方面的研究不多。脯氨酸(Proline, Pro)因其分子量小、水溶性大、对细胞无毒副作用,是植株内最重要的有机渗透调节物质,几乎所有的逆境如干旱、高温、低温、盐渍、冰冻、大气污染等都会造成植株内脯氨酸的积累[10-11]。在盐胁迫下,植物通过主动积累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、甜菜碱、多胺等有机渗透调节物质,发挥它们的渗透调节作用,以维持细胞膨压,从而提高细胞的渗透调节能力[12]。已有研究证实,外源脯氨酸可以提高高温胁迫和盐胁迫下黄瓜[13]、甜瓜[14]等蔬菜作物的抗渗透胁迫能力,但尚未见盐胁迫下外源脯氨酸对萝卜体内抗氧化系统及有机渗透调节物质的影响等相关报道。因此,本文以萝卜为试验材料,研究了外源脯氨酸对NaCl单盐胁迫下萝卜幼苗生长、抗氧化系统及渗透调节物质积累的影响，以期为明确外源脯氨酸提高盐胁迫下萝卜植株的耐盐性机制提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

以四季萝卜品种扬花萝卜为试验材料。先用自来水连续冲洗萝卜种子1遍,再用蒸馏水清洗2次,然后播于铺有滤纸的培养皿内,置于28 ℃的培养箱中催芽。待种子全部破白后,取发芽一致的种子播种于128孔穴盘中,育苗基质采用“优佳”牌蔬菜育苗专用基质(由江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所研制生产)。当幼苗生长至2叶1心时,选择整齐一致的植株定植于装有1/2 Hoagland营养液的水槽内进行预培养,营养液pH值调节为6.5±0.2,电导率(EC)调节为(2.3±0.2)ms/cm。利用通气泵进行间歇通气,保持适宜的溶解氧浓度。在预培养5 d后,将萝卜幼苗分为以下4组,设置处理如下:正常营养液培养(对照)，1/2 Hoagland营养液;脯氨酸处理，1/2 Hoagland营养液+0.3 mmol/L Pro; NaCl胁迫处理，1/2 Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl; NaCl胁迫+Pro处理，1/2 Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl+0.3 mmol/L Pro。每个处理30株苗,3次重复；为了保证营养液的稳定,营养液每两天更换1次。

1.2 测定方法

1.2.1 幼苗生长指标的测定 在处理7 d后,每处理分别取10株幼苗,用直尺分别测定其株高和主根长度；再将幼苗用自来水冲洗干净,再用蒸馏水漂洗2次,吸干表面水分后,将幼苗从根茎连接处剪断,分别称取地上部及地下部鲜重；然后将样品置于105 ℃的烘箱中杀青15 min,在75 ℃下烘干至恒重,再分别称取地上部及地下部干重。

1.2.2 抗氧化酶活性的测定 分别于处理后第0、1、4、7、10天取幼苗生长点下第2片展开的真叶，进行抗氧化酶活性的测定。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[15],以抑制NBT光化还原的50%酶量为1个酶活力单位(U)； POD活性的测定采用愈创木酚法,按照李合生[16]的方法，测定470 nm处的OD值,以OD470每分钟增加0.01为1个酶活力单位(U);过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用李合生[16]的方法,以OD240每分钟减少0.1为1个酶活力单位(U)。以上酶活性的计量单位均为U/mg。

1.2.3 渗透调节物质含量的测定 分别于处理后第0、1、4、7、10天取幼苗生长点下第2片展开的真叶，进行渗透调节物质含量的测定。可溶性总糖含量的测定采用蒽酮比色法,可溶性蛋白含量的测定采用Bradford考马斯亮蓝G-250法,均按照李合生[16]的方法测定。脯氨酸(Pro)含量采用水合茚三酮法[17]测定。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和DPS v14.10高级版对试验数据进行处理和统计分析,用Duncan’s新复极差法进行平均数间的多重比较,使用SigmaPlot 12.0软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 外源Pro对盐胁迫下萝卜幼苗生长指标的影响

由表1可知,萝卜幼苗经100 mmol/L NaCl处理7 d后,其地上部鲜重、干重,地下部鲜重、干重,以及株高与主根长等指标均全面下降,且与对照相比差异达显著性水平(P<0.05),表明在NaCl胁迫下萝卜幼苗的生长受到了显著抑制。与对照相比,经0.3 mmol/L的Pro处理后萝卜各项生长指标(除根冠比外)均有所提高,但差异未达显著性水平。在NaCl胁迫下施用0.3 mmol/L Pro后,萝卜的主要生长指标(除地下部鲜重、干重和根冠比外)均比单纯NaCl胁迫时有显著提高,且对地上部鲜重和干重的提高幅度均大于对地下部鲜重和干重的提高幅度,表明Pro可以有效地提高萝卜幼苗在盐胁迫下的耐盐性,且对地上部的促进效果要强于地下部。

表1 外源Pro对盐胁迫下萝卜幼苗生长的影响

注:同列数据后附不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。Pro处理:0.3 mmol/L Pro; NaCl处理:100 mmol/L NaCl; NaCl+Pro处理:100 mmol/L NaCl+0.3 mmol/L Pro。

2.2 外源Pro对盐胁迫下萝卜幼苗抗氧化酶活性的影响

由图1可知：在盐胁迫处理前,各处理间萝卜幼苗的SOD、POD、CAT活性均无显著差异；经Pro预处理萝卜幼苗的SOD、POD、CAT活性始终略高于对照；在NaCl胁迫下SOD活性明显上升,于胁迫后第7天达到峰值,比对照增加了32.13%,但在胁迫维持10 d后其活性比峰值时下降了15.80%,但依然略高于对照；在NaCl+Pro处理下SOD活性显著上升,至第7天时活性达到峰值,与单纯NaCl胁迫相比有显著性差异(P<0.05),但此后SOD活性明显下降。

POD活性的变化趋势与SOD相似,在NaCl处理以及NaCl+Pro处理下POD活性均于第7天时达到峰值,且NaCl+Pro处理的POD活性与单纯NaCl处理间存在显著性差异(P<0.05),但此后POD活性均有所下降。

在NaCl胁迫下CAT活性的变化趋势与SOD、POD略有不同。随着胁迫时间的延长,CAT活性缓慢上升,但NaCl+Pro处理下的CAT活性与单纯盐胁迫相比有明显上升,并在胁迫后10 d达到峰值,比单纯NaCl胁迫下的CAT活性提高了42.50%。

图1 外源脯氨酸对盐胁迫下萝卜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

2.3 外源Pro对盐胁迫下萝卜幼苗体内有机渗透调节物质积累的影响

由图2可知,经Pro预处理的萝卜植株叶片内游离Pro、可溶性糖的含量在整个处理期内均明显高于对照,而可溶性蛋白的含量则与对照无显著差异。100 mmol/L的NaCl胁迫显著提高了萝卜幼苗叶片内游离Pro、可溶性糖和可溶性蛋白的含量,至处理第10天时达到峰值,与对照相比,3个指标分别提高了31.25%、19.58%和45.49%。在NaCl胁迫下施加外源Pro后,萝卜幼苗叶片内游离Pro、可溶性糖和可溶性蛋白的含量进一步增加,其中游离Pro的含量比对照增加了68.96%,比单纯盐胁迫增加了28.73%,而可溶性蛋白的含量与单纯盐胁迫相比无显著差异。

3 讨论

在盐胁迫下,土壤中高浓度的盐离子会降低土壤水势,产生渗透胁迫,直接影响植物细胞的代谢和植物对营养物质的吸收,严重抑制植物的生长发育。在本实验中，经100 mmol/L NaCl处理7 d,萝卜幼苗的主要生长指标均显著下降,而根冠比有所提高,说明100 mmol/L NaCl胁迫对萝卜幼苗地上部的抑制作用要大于对地下部的抑制作用。这与陈丽芳等[18]在黄瓜上的研究结果相似,但并不能说明盐胁迫可以提高萝卜植株的根冠比。事实上,随着盐浓度的升高,大部分植物根系受损严重,导致根冠比明显下降。王玉凤[19]使用100 mmol/L NaCl处理玉米幼苗,其植株根冠比为0.50,当NaCl浓度提高到200 mmol/L时,根冠比下降为0.43。结合本试验结果，我们认为根系是植物最重要的负责营养吸收的器官,在中、低盐浓度下,植株为了抵抗逆境,幼苗根系生长受抑制程度小于地上部,而相对强大的根系有利于植物抵抗逆境胁迫;在高盐浓度下,根系受到较强的渗透胁迫和离子胁迫的影响,其生长受到严重抑制,导致根冠比下降明显。

图2 外源脯氨酸对盐胁迫下萝卜幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

植物在正常生长情况下,其体内活性氧(ROS)的产生和清除处于一个动态平衡中,不会对植株造成伤害。但在盐胁迫条件下,这种平衡被打破,造成ROS的积累[20]。过量的ROS会启动膜脂过氧化连锁反应并作用于膜蛋白,使膜脂不饱和度和膜流动性降低、膜透性增加。为了保护细胞免受过量的ROS的伤害,植株发展了一套完整的防御系统,即活性氧清除系统。SOD、POD、CAT等作为作物体内重要的保护酶系统此时被激活,它们作为自由基净化剂能够消除盐胁迫下产生的活性氧和过氧化物自由基,维持植株内活性氧代谢的平衡,确保细胞膜结构的稳定性,抵御和修复逆境对植株造成的伤害[21]。许多研究表明,植株在盐胁迫下,其抗氧化酶的活性会相应升高,耐盐品种相比于盐敏感性品种其活性更高[22-23]。Mittova等[24]发现,与栽培番茄品种相比,野生型番茄品种的SOD、POD活性升高能更好地保护植株免受氧化胁迫损害。植物内抗氧化酶活性的高低往往决定着植物抗逆能力的强弱[25]。

本研究结果表明：使用100 mmol/L NaCl处理,明显促进了萝卜幼苗叶片内SOD、POD、CAT的活性；在盐胁迫下施加外源Pro则进一步增强了以上3种抗氧化酶的活性。说明在盐胁迫下,植物通过增强一系列抗氧化酶的活性来抵抗逆境。但是当逆境胁迫超过一定的时间后,逆境对植株所造成的破坏会超出植物的自我调节能力,此时抗氧化酶的活性就会明显下降[26]。本研究中SOD、POD的活性变化即是如此,说明经100 mmol/L NaCl处理10 d,逆境已经对萝卜细胞造成了一定的伤害,现有的抗氧化酶系统已经不足以抵抗过量的ROS所形成的氧化胁迫,随着盐胁迫的持续,必然导致膜损伤,进而影响细胞代谢作用,引起一系列的代谢失调[27-29]。

在盐胁迫下,植物吸水困难,造成渗透胁迫。这时植物会大量合成脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、甜菜碱等渗透调节物质,以协调细胞与外界的渗透压平衡,保护细胞膜与蛋白质活性,以维持细胞的正常功能。其中脯氨酸是植株内最重要、也是目前研究最广泛[30-31]的一类渗透调节物质。Huang Y等[32]研究发现施加适宜浓度的脯氨酸可显著缓解盐胁迫下作物幼苗气孔导度的下降,提高水分和CO2的利用率,还可以有效清除作物体内的ROS,减轻盐胁迫对叶绿素的破坏,维持叶绿素的功能。植株内可溶性碳水化合物对盐胁迫、干旱胁迫的响应机制也已被广泛报道[33]。Ashraf M等[34]在测定5种耐盐性不同的向日葵的总可溶性糖含量后发现,耐盐品种与盐敏感性品种相比,其可溶性糖的积累量显著增高。Lopez等[35]研究发现在萝卜中存在着22 kDa的蛋白专门响应盐胁迫。在盐胁迫下植物积累的这些可溶性蛋白可能是胁迫诱导而合成的,也可能是在非胁迫下以低浓度存在,而在胁迫下短时大量积累的,主要在渗透调节中发挥作用。本研究结果表明,100 mmol/L的NaCl胁迫明显促进了萝卜幼苗叶片内的游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的积累,有利于增强植株对盐胁迫的抗性,而盐胁迫下施加外源脯氨酸则进一步促进了游离脯氨酸的大量合成,促进了可溶性糖和可溶性蛋白的积累,维持了细胞渗透压平衡,提高了植株的渗透调节能力,增强了植株对盐胁迫的抗性。可见,在盐胁迫等逆境条件下,脯氨酸的大量积累对降低植物的渗透胁迫起到积极作用,有助于维持细胞的正常代谢,但也可以认为其是逆境胁迫的产物,是植物受到逆境伤害的征兆[36]。

4 结论

综上所述,100 mmol/L的NaCl胁迫抑制了萝卜幼苗的生长,提高了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性,促进了有机渗透调节物质的积累。在盐胁迫下施加外源脯氨酸则缓解了盐胁迫对萝卜幼苗生长的抑制作用,进一步提高了抗氧化酶系统的活性和有机渗透调节物质的含量,保护了细胞膜结构的稳定性,增强了植株对胁迫的适应能力。