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CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

2019-04-04苏文英杨和川谭一罗付永平

江西农业学报 2019年3期
关键词:真菌基因组效率

苏文英,杨和川,谭一罗,李 晓,付永平*,李 玉*

(1.连云港市农业科学院,江苏 连云港 222006;2.吉林农业大学 食药用菌教育部工程中心,吉林 长春 130118)

随着分子生物学技术的快速发展,基因编辑技术已经成为基因组改造和基因功能研究的热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率比较低,限制了基因打靶技术的应用。后来,研究者们用改造过的人工核酸内切酶(Engineered Endonuclease,EEN)在基因组的特定位置使DNA双链断裂,并在修复过程中达到基因定点编辑的作用,人工核酸内切酶的出现,彻底改变了基因编辑效率低的这一现状[1]。早期的EEN介导的基因编辑技术主要包括锌指核酸内切酶技术(Zinc-finger Nucleases,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcription Activator-like Effector Nucleases,TALEN),这2种技术的作用原理都是通过DNA结合蛋白与核酸内切酶Fok Ⅰ组成蛋白复合物对靶点进行特异性的识别和切割[2]。然而,这2项技术在操作过程中不仅费时费力,而且对操作技术要求很高,因而在普通实验室很难被有效利用。2013年初,新型基因编辑技术CRISPR/Cas系统进入人们的视野[3],因其制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速在作物品种改良[4-8]、动物模型构建[9-10]、疾病治疗研究[11-13]、发酵菌株代谢途径改造[14-15]等领域得到了广泛的应用。但在真菌中,由于部分真菌同源重组率极低、高效遗传转化体系的缺乏、启动子和有效筛选标记的缺乏等原因,阻碍了该技术在真菌中的发展。本文综述了近几年CRISPR/Cas9技术在真菌中的开发和应用,以期为进一步加快真菌基因编辑研究提供参考。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术及其作用原理

1.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述

1987年,日本学者首次在大肠杆菌(Escherichiacoli)碱性磷酸酶基因(Alkaline Phosphatase,IAP)的侧翼序列中发现了成簇的有规律间隔的短回文重复序列[17];Jansen等[18]将其正式命名为成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)。之后,研究者发现在40%的细菌和90%的古细菌的基因组中都存在CRISPR位点[19]。Barrangou等[20]对嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)进行遗传改造时,发现嗜热链球菌的CRISPR/Cas Ⅱ型系统能够抵抗外源噬菌体的入侵。随着研究的进一步深入,Marraffini等[21]发现细菌中的CRISPR系统能抵御外源质粒的转移,并通过实验验证了CRISPR系统的功能。Feng Zhang团队的Cong L等[22]和George M. Church团队的Mali P等[23]同时在《Science》杂志上在线报道了应用sgRNA介导的Cas9核酸酶对哺乳动物细胞基因组的特异性打靶。此后,利用该技术在不同生物中进行基因编辑的工作陆续展开。

1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用原理

由于Cas基因的多样性异常丰富,研究者根据Cas基因核心元件序列的不同,将CRISPR/Cas免疫系统分为Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ共3种不同类型。TypeⅠ系统主要存在于细菌和古生菌中,结构最为复杂,特征蛋白为Cas3 蛋白,该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能[24];Type Ⅲ系统的特征蛋白为Cas10 蛋白,该蛋白具有RNA 酶活性[25]。而在这3种不同类型中,由于Type Ⅱ型系统的结构简单,除去crRNA和tracrRNA外,只有一个标志性Cas9蛋白来切割DNA双链,并且它仅存在于细菌中[26]。因此到目前为止,被改造的最为成功的人工核酸内切酶是产脓链球菌(Streptococcuspyogenes,SF370)的Type Ⅱ型系统,并且已经在多种生物中成功实现了基因组定点修饰。

CRISPR/Cas的组织结构相对简单。以产脓链球菌SF370的Type Ⅱ型结构为例,其结构可被分为3个部分:第一部分为5′端的转录激活RNA(tracrRNA)基因;第二部分为中间一系列与CRISPR相关的Cas(CRISPR-associated)蛋白,目前发现有6个核心Cas蛋白,包括Cas9、Cas1、Cas2、Csn2,其中Cas9蛋白包含2个独特的功能结构域HNH和类RuvC核酸酶亚基,它们分别切割DNA双链,从而产生基因定点突变;第三部分为3′端的CRISPR基因座,由前导区(Leader)、间隔区(Spacers)以及多个重复序列(Direct repeats)顺序连接而成[27]。

CRISPR/Cas9的作用机理大体可以分为3个步骤:(1)外源质粒上与CRISPR基因座上对应的序列被称为protospacer,它的5′端或3′端的3~5个保护碱基,被称为PAM(Protospacer Adjacent motif)序列。当外源质粒入侵时,通过识别PAM序列来将其附近的序列定为protospacer,然后该序列被整合到CRISPR基因座的两个重复序列间,即获得间隔序列;(2)当外源质粒再次入侵时,CRISPR基因座与插入的新间隔序列首先被转录成长的前体RNA(pre-crRNA),然后在Cas蛋白和RNase Ⅲ核酸酶的作用下被加工成含有间隔序列的crRNA;(3)然后,crRNA与特异的Cas蛋白以及转录激活RNA tracrRNA形成复合物crRNA- tracrRNA,再通过PAM序列扫描外源入侵DNA上的靶序列,crRNA上的间隔序列与靶序列进行互补配对,最后Cas9蛋白发挥切割酶活性,外源噬菌体或是质粒DNA在配对的特定位置被切割,从而达到防御的目的[28]。具体的作用机理如图1所示。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

2.1 在酵母菌中的应用

2.1.1 酿酒酵母 早在2013年,DiCarlo等[30]就将CRISPR/Cas9技术应用到了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,研究者将携带 sgRNA的质粒与供体DNA同时转至含有组成型表达的Cas9细胞中,使供体DNA的同源重组率接近100%,而且相较于传统的同询重组技术,该技术使单链及双链靶基因断裂效率分别提高5倍和130倍,该研究为后续酵母基因定点突变和等位基因替换研究提供了强有力的支撑。随后,Bao等[31]构建了一步实现多基因敲除的CRISPR-Cas系统——HI-CRISPR(Homology-Integrated CRISPR-Cas),在对酿酒酵母进行基因编辑时,其中3种基因CAN1、ADE2、LYP1在4 d内同时被破坏,效率为27%~87%;另外3个基因ATF2、GCY1、YPR1在6 d内同时被破坏,效率为100%,该研究实现了在酿酒酵母中进行多基因编辑,大大提高了基因编辑效率。

2.1.2 裂殖酵母 裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)与真核生物基因组的相似性高于酿酒酵母,但由于分子工具的缺乏,关于裂殖酵母的研究不如酿酒酵母深入。特别是由于缺乏用于表达sgRNA的启动子而阻碍了CRISPR/Cas9基因组编辑体系在裂殖酵母中的实施。2014 年,Jacobs 等[32]开发了应用于裂殖酵母中的CRISPR/Cas9系统,在该研究中研究者利用RNA(rrk1)的启动子构建靶向指导RNA的表达载体,与组成型Cas9相结合,在裂殖酵母中实现无筛选标记的特异性诱变,诱变效率接近100%,实现了在裂殖酵母中进行特定、精确和高效的基因组编辑。

图1 CRISPR/Cas系统的作用机理[29]

2.1.3 白色假丝酵母 Shapiro等[33]建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因驱动平台(Gene Drive Array,GDA),能够在二倍体病原体中进行基因操作及快速形成突变体,该研究被用于对白色假丝酵母(Candidaalbicans)高效基因编辑中,在此研究中,一种DNA切割的Cas9酶靶向2个区域,位于单倍体白色念珠菌真菌中一个基因的两侧,由两个所谓的“向导 RNA”(gRNAs) 基因组成。在靶向基因序列被切断后,一种基因驱动的盒式表达,将所有的 Cas9 和 gRNA 组件插入其位置。当2个单倍体菌类交配形成二倍体后代时,基因驱动也将替代基因在另一个染色体上的对应基因,得到目标基因有效地从机体完全删除的原始版本。这项研究为了解白色念珠菌致病机制和耐药性提供了新的途径。

2.2 在霉菌中的应用

2.2.1 里氏木霉 2015年,Liu等[34]通过特定的密码子优化和体外RNA转录,融合增强的绿色荧光蛋白(eGFP)对其进行检测,建立了适用于丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的CRISPR/Cas9系统,不仅可以在同源臂较短的条件下实现靶基因高效率的同源重组,也可对多个靶基因进行同时编辑。CRISPR/Cas9系统在里氏木霉中的成功应用,为进一步加速丝状真菌的功能基因组学和菌株改良研究奠定了基础。

2.2.2 米曲霉 Katayama等[35]利用CRISPR/Cas9系统对工业菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)基因组进行了编辑,在该研究中研究者利用amyB作为Cas9的启动子,来自米曲霉的U6 启动子作为gRNA 启动子,SV40作为核定位信号,FLAG-tag作为蛋白表达与否的检验标记,构建了靶向于wA、yA、pyrG基因的载体,突变率在10%~20%之间,结果表明:单碱基的缺失或插入突变较多,且不会对米曲霉的生长造成影响。该技术在米曲霉中的应用有利于后续米曲霉定向诱变研究。

2.2.3 烟曲霉 Zhang等[36]在烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中建立了以 CRISPR/Cas9 技术为基础的微生物学介导的末端连接(Microhomology-Mediated End Joining,MMEJ)靶基因突变系统,不仅实现了精确高效的靶基因编辑,并且通过35 bp的同源臂就可使基因的编辑效率高达95%~100%。

2.2.4 水稻稻瘟病菌 在水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)中,Arazoe等[37]分别利用内源性的 RNA 聚合酶Ⅲ(RNA polymerase, RNAP)所识别的U6启动子和 RNA 聚合酶Ⅱ控制的TrpC启动子表达 sgRNA,同时发现利用RNA聚合酶Ⅲ识别的U6启动子比利用 RNA 聚合酶Ⅱ识别的TrpC启动子进行基因组编辑的效率更高,这表明驱动sgRNA的启动子也会影响敲除效率。

2.2.5 玉米黑粉菌 在玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中,Schuster等[38]使用密码子优化的Cas9蛋白、组成型强启动子Potef、gRNA以及来源于自身的U6 启动子构建CRISPR/Cas9基因编辑体系,通过单步转化法导入,对基因bE2和bW1进行编辑,结果表明:突变效率高达70%,为后续玉米黑粉菌致病基因功能的研究提供了很大的帮助。

2.3 在蕈菌中的应用

2.3.1 双孢蘑菇 2016年宾夕法尼亚大学的杨亦农教授利用该技术对双孢蘑菇(Agaricusbisporus)中控制褐变的多酚氧化酶(PPO)的基因进行了基因编辑,并将该酶的活性降低了30%,使其抗褐变。此研究虽然没有公开具体操作过程,但这是基因编辑技术在大型真菌中的首次应用[39]。

2.3.2 灰盖鬼伞 2017年,Sugano 等[40]构建了应用于大型真菌模式生物灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)中的高效的基因组编辑体系,在此研究中,作者利用高通量转化方法筛选获得的一个活性高出常规启动子GPD活性7倍的新启动子——CcDED1pro,然后将该启动子作用于Cas9蛋白,来自灰盖鬼伞的U6-snRNA启动子表达gRNA,构建载体,利用PEG介导法转化冷冻保存的原生质体。最后,利用上述体系在稳定的 GFP 表达体系中进行 CRISPR/Cas9 介导的 GFP 诱变,并在菌丝和子实体中成功检测到了GFP 功能的丧失。该研究加速了大型真菌遗传及分子育种研究。

2.3.3 金针菇 刘建雨等[41]将SpCas9根据金针菇(Flammulinavelutipes)密码子偏好性进行了密码子优化并合成FvCas9全长序列,构建了FvCas9双元表达载体,通过农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,并成功获得了转化子。

2.3.4 灵芝 Qin等[42]在灵芝(Ganodermalucidum)中成功应用了CRISPR/Cas9系统,在此研究中,作者应用T7启动子表达gRNAs,来源于灵芝自身的Pgpd启动子和来自里氏木霉的Tpdc终止子作用于Cas9,然后利用PEG介导法转化灵芝原生质体,靶向破坏灵芝中阻碍灵芝酸合成的基因——URA3,并成功获得了转化子,转化效率高达66.6%,从而使灵芝产生更多具有抗肿瘤活性和抗转移活性的灵芝酸。该研究为未来更高级真菌的深入研究和应用提供了有效的平台。

2.3.5 蛹虫草 孙丹[43]将植物敲除载体pFGC-pco Cas9 通过PmeⅠ和NcoⅠ两种限制性内切酶将用于真菌的GPD启动子成功地构建到pFGC-pco Cas9中,从而成功改造了适用于真菌敲除的载体,利用农杆菌介导法转化蛹虫草(Cordycepsmilitaris)原生质体,得到关于URA3基因(gRNA1+gRNA2)的转化子共 70+52个,其中gRNA1的突变率为2.8%,gRNA2突变率为2.0%。随后,Chen等[44]通过密码子偏好性对Cas9酶进行优化,并将其与新报道的启动子Pcmlsm3和终止子Tcmura3一起表达,构建了应用于蛹虫草的CRISPR/Cas9系统,并通过荧光GFP标签和蛋白质印迹分析证明该系统可以稳定表达。利用农杆菌介导法将体外合成的sgRNA和供体单链DNA(ssDNA)转化蛹虫草原生质体,利用5-FOA作为筛选标记,并成功获得转化子。该研究为进一步提高虫草素的产量,促进相关产业的发展提供了技术支持。

随着被成功测序的蕈菌数目的增加及实验技术的进步,寻找子实体发育的关键基因,并探究不同基因的具体功能和参与的调控机制也变得越来越重要。目前CRISPR/Cas9 系统在蕈菌中的应用还比较少,且多集中在CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立,并且突变体的筛选多依靠测序完成,工作量很大。相信随着CRISPR/Cas9技术的不断改进和完善,科学家们能够建立一种高效简便的CRISPR/Cas9基因编辑体系,为蕈菌功能基因挖掘、遗传育种研究奠定基础。

3 影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的因素

首先,该系统最大的问题就是脱靶率较高,CRISPR/Cas9 基因编辑系统的特异性取决于 sgRNA 上的识别序列,因此如何设计高效、特异性的sgRNA是降低脱靶效率的关键。研究表明,在设计sgRNA 时,高C/G含量百分比可以有效降低脱靶率[45]。在设计 gRNA 时,可通过特定算法预测潜在脱靶位点,尽可能选择脱靶效应低的 gRNA,现在已使用各种算法的专业软件来降低脱靶效率,如Cas-OFFinder、CRISPR Design Tool、CasFinder、CHOPCHOP、CRISPOR、E-CRISPR等软件。此外,研究发现降低sgRNA的浓度也有助于降低脱靶率[46]。另一项研究也表明,较长的 PAM 序列能够有效地减少脱靶效应[47]。

其次,同源臂的长短、质粒的浓度、启动子及筛选标记的选择以及是否建立了高效的遗传转化体系等因素都会影响CRISPR/Cas9系统的编辑效率。Paix等[48]研究发现由33~38个核苷酸组成的同源臂与由518个核苷酸组成的同源臂成功率相当,最优编辑条件下的成功率为10%~20%。Zhang等[36]在烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中的研究也表明:通过35 bp的同源臂就可使基因的编辑效率高达95%~100%,并且使用gpdA或niiA等强启动子驱动 Cas9的表达能有效提高敲除效率。Arazoe等[37]研究表明:采用U6启动子表达 sgRNA进行基因编辑的效率高于tripC启动子。这些研究都进一步表明不同来源的启动子的靶标范围、精准度和表达效率也不相同。

Matsuura等[49]发现,在一定的范围内,Cas9和gRNA载体的浓度越高,转化效率越高。Schuster 等[38]认为在制备原生质体时,如果采用混合的破壁酶将会导致脱靶率较高。此外,CRISPR/Cas9技术主要是通过基因枪和农杆菌介导的受体遗传转化法来实现将CRISPR/Cas9系统带入到受体体内。所以,稳定高效的遗传转化体系也是CRISPR/Cas9成功高效运用的因素之一。因此,在今后的应用过程中,仍然要对这些影响基因编辑效率的因素进行进一步优化,加速推动该技术在真菌中的应用。

4 结语

综上所述,利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术可以有效地对真菌的靶基因进行编辑,利用该体系不仅可以对单个的目的基因进行编辑,也可对基因家族、整个基因座及代谢通路中的多个基因同时进行编辑。并且与ZFN和TALEN这两种传统的人工核酸酶相比,CRISPR/Cas9系统构建简单、方便、快捷,且对细胞毒性小。但是运用过程中出现的脱靶、编辑效率低以及突变体筛选工作量大等问题也亟待解决。相信在不久的将来,随着CRISPR/Cas9技术的改进和完善,真菌基因组的编辑将会变得越来越简单,为进一步推进真菌功能基因组学及遗传育种研究带来突破性进展。

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