河南省规模化猪场ESBLs大肠杆菌耐药基因检测及分析

张成东，曲久燕*，李德喜，郭海岩，刘梦龙，崔松涛

(1.河南牧翔动物药业有限公司 猪药市场部，河南 郑州 450000；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450000)

β-内酰胺类抗生素是医学及兽医学上使用最早、用量最大的一类抗生素，随着第三代头孢菌素的广泛应用，临床上也出现了不同程度的耐药菌[1]。细菌通过产生β-内酰胺酶和超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)破坏β-内酰胺类抗生素，从而产生耐药性。近年来，由于各种广谱及超广谱药物的广泛应用，尤其是不合理应用，使致病菌对抗生素的耐药性急剧上升，多重耐药菌株不断增多[2]，从而影响了药物的使用。

ESBLs耐药基因包括CTX-M、TEM、SHV和OXA等[3]，这些基因常定位于质粒上，易于扩散转移，加速耐药基因的传播。

大肠杆菌是人畜肠道共栖菌和条件性致病菌[4-5]，也是产广谱β-内酰胺酶的代表菌之一。目前对河南省动物源大肠杆菌ESBLs基因研究较多[6-12]，但对猪源大肠杆菌ESBLs基因的系统研究相对较少，不能充分代表河南猪源大肠杆菌ESBLs耐药基因流行情况。因此，本研究从河南6个地区的10个规模化猪场入手，旨在更客观地了解猪源性大肠杆菌的ESBLs基因的流行情况及基因型分布情况，不仅可为大肠杆菌相关疾病防控提供科学依据，而且可为猪场兽医临床合理用药提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样对象 2018年8月从豫东(兰考县、曹县)、豫北(辉县、淇县)、豫西(博爱县、沁阳市、宜阳县)、豫南(遂平县、西平县)6个地市9个县的10个规模化猪场(母猪存栏300～2000头)取母猪直肠分泌物436份、哺乳仔猪直肠分泌物425份。

1.1.2 标准菌株 大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922，购自中国药品生物制品鉴定所。

1.1.3 培养基 脑心浸液肉汤(BHI)、麦康凯琼脂购自北京陆桥生物技术有限公司，ECC购自博赛科玛嘉。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离培养 用灭菌棉棒采猪直肠拭子置入5 mL采样转运培养基中，分别取一环菌液划线于麦康凯培养基进行大肠杆菌的初筛分离，37 ℃过夜培养，选取粉红色菌落，接种到ECC平板，对大肠杆菌进行纯化。

1.2.2 引物设计与合成 根据Genbank公布的ESBLs基因序列，参照文献[13]和[14]的合成引物，引物由苏州鸿讯生物技术有限公司合成。

1.2.3 DNA模板提取 采用煮沸法提取菌株DNA模板。挑取过夜培养后处于对数生长期的菌落调入含500 μL无菌生理盐水的1.5 mL离心管内，充分混匀，放入100 ℃沸水浴中煮沸15 min。10000 r/min离心30 s后，吸取上清液即为扩增模板。从平板挑取疑似大肠杆菌单克隆于2 mL LB肉汤中，37 ℃恒温摇床200 r/min震荡培养过夜(约12 h)。菌液离心富集后，加入灭菌的蒸馏水100 μL重悬沉淀。100 ℃煮沸30 min，取出后立即冰浴10 min。12000 r/min离心3 min，取80 μL上清作为PCR模板，-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4 ESBLs菌基因的PCR检测 各目的基因片段扩增体系均为20 μL，反应所用的试剂和扩增程序见表1，PCR扩增产物经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。

表1 PCR扩增体系及其扩增程序

2 结果与分析

2.1 细菌分离情况

河南省6个地区10个猪场861份(母猪436份，哺乳仔猪425份)直肠分泌物中共分离出704株大肠杆菌(图1、图2)，分离率为81.77%；其中母猪分离出419株大肠杆菌，检出率为96.10%；哺乳仔猪分离出285株，检出率为67.06%。

图1 大肠杆菌麦康凯培养基分离

2.2 ESBLs 菌耐药基因检测及分析

对704株大肠杆菌用8对ESBLs基因扩增引物进行PCR检测，检测结果显示，共从580株菌中检测出ESBLs基因(表2)，检出率为82.39%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分别检出552、231、173和18株，检出率分别为78.41%、32.81%、24.57%和2.56%；检测到1种耐药基因的ESBLs菌284株，占总检测菌株的40.34%；检测到2种及以上耐药基因的ESBLs菌296株，占总检测菌株的42.05%(其中2种耐药基因203株、3种耐药基因88株、4种耐药基因5株，分别占总检测菌株的28.84%、12.50%、0.71%)；TEM+CTX-M基因型ESBLs菌224株，占总检测菌株的31.82%；TEM+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌82株，占总检测菌株的11.65%；TEM+SHV+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌5株，占总检测菌株的0.71%。由PCR检测结果可知，河南省规模化猪场ESBLs菌阳性率高达82.39%，CTX-M、TEM和OXA是引起ESBLs耐药的主要基因，表明河南规模化猪场广泛存在耐β-内酰胺类抗生素的大肠杆菌。部分阳性菌株PCR扩增片段电泳阳性图见图3。

图2 大肠杆菌科玛嘉ECC培养基鉴定

2.3 母猪ESBLs菌耐药基因检测及分析

对母猪样本分离出的419株大肠杆菌进行ESBLs基因PCR检测，检测结果(表3)显示:共从336株菌中检测出ESBLs基因，检出率为80.19%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分别检出322、144、61和7株，检出率分别为76.85%、34.37%、14.56%和1.67%；检测到1种耐药基因的ESBLs菌180株，占总检测菌株的42.96%；检测到2种及以上耐药基因的ESBLs菌156株，占总检测菌株的37.23%(其中2种耐药基因117株、3种耐药基因36株、4种耐药基因3株，分别占总检测菌株的27.92%、8.59%、0.72%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌138株，占总检测菌株的32.94%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌37株，占总检测菌株的8.83%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌3株，占总检测菌株的0.72%。由PCR检测结果可知，河南省规模化猪场母猪ESBLs菌阳性率高达80.19%，CTX-M和TEM是引起ESBLs耐药的主要基因。

表2 河南省规模化猪场ESBLs基因PCR检测情况

1.CTX-M-2，2.CTX-M-9，3.TEM，4.OXA，5.SHV

2.4 仔猪ESBLs菌耐药基因检测及分析

对哺乳仔猪样本分离出的285株大肠杆菌进行ESBLs基因PCR检测，检测结果显示，共从244株菌中检测出ESBLs基因(表4)，检出率为85.61%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分别检出230、87、112和11株，检出率分别为80.70%、30.53%、39.30%和3.86%；检测到1种耐药基因的ESBLs菌104株，占总检测菌株的36.49%；检测到2种及以上耐药基因的ESBLs菌140株，占总检测菌株的49.12%(其中2种耐药基因86株、3种耐药基因52株、4种耐药基因2株，分别占总检测菌株的30.18%、18.25%、0.70%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌86株，占总检测菌株的30.18%；CTX-M+OXA基因型ESBLs菌98株，占总检测菌株的34.39%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌45株，占总检测菌株的15.79%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌2株，占总检测菌株的0.70%。由PCR检测结果可知，河南省规模化猪场哺乳仔猪ESBLs菌阳性率高达85.61%，CTX-M、OXA和TEM是引起ESBLs耐药的主要基因,哺乳仔猪ESBLs菌耐药基因携带情况比母猪更复杂。

表3 河南省规模化猪场母猪ESBLs基因PCR检测情况

2.5 不同猪场ESBLs菌耐药基因检测及分析

在河南省10个规模化猪场分离的大肠杆菌中(图4)，1场(样本量：母猪30+哺乳仔猪29)和2场(样本量：母猪21+哺乳仔猪24)ESBLs菌的检出率最高，均为100%；其次是5场和6场的检出率为94%以上，7场、10场和4场的检出率为80%以上，8场的检出率最低，为54.55%。豫东地区的1场和2场耐药基因型最复杂，CTX-M、TEM、OXA基因检出率分别为96.61%、100%、74.58%和100%、95.65%、57.78%，其中1场ESBLs菌耐药基因型最多，同时携带CTX-M、TEM、OXA和SHV基因型的菌株检出率为8.47%，其余各场不存在同时携带4种基因型的菌株；豫北地区的3场耐药基因最单一，仅CTX-M基因的检出率最高，为71.03%；豫南地区的8场、9场和10场，OXA基因的检出率高于TEM基因，其他猪场TEM基因的检出率大于OXA基因检出率。

表4 河南省规模化猪场哺乳仔猪ESBLs基因PCR检测情况

3 结论与讨论

本研究结果显示，河南省豫东、豫西、豫南、豫北10个规模化猪场分离的704株大肠杆菌，耐药基因检测ESBLs菌检出率为82.39%(580/704)，高于2009年河南地区报道的78.26%(36/46)[8]和2015年闽西地区报道的28.6%[14]。本研究发现，携带1种耐药基因ESBLs菌284株，占总检测菌株的40.34%，同时携带2种及以上耐药基因的ESBLs菌296株，占总检测菌株的42.05%，说明了河南省产ESBLs大肠杆菌耐药基因更为复杂，规模化猪场广泛存在耐β-内酰胺类抗生素的大肠杆菌，河南省ESBLs菌耐药现状及变化趋势不容乐观。

有报道表明，不同国家和地区产ESBLs大肠杆菌的基因型存在一定差异[1，15-17]，我国大陆主要为CTX-M和SHV基因型，与本研究有一定差异。本研究显示，704株大肠杆菌的CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、TEM、OXA和SHV8种基因亚型的检出率分别为0、38.35%、0、69.89%、0、32.81%、24.57%和2.56%，显示河南省猪源ESBLs大肠杆菌主要为CTX-M型，TEM型和OXA型次之，SHV型最少，与江西地区较为相似[18]。豫东地区猪场耐药基因型最复杂，主要为CTX-M、TEM、OXA三种基因型，豫北和豫西地区，主要为CTX-M和TEM两种基因型，与贵州地区较为接近[19]；豫南地区主要为CTX-M和OXA两种基因型。本研究发现，母猪群ESBLs大肠杆菌中，TEM基因型检出率(34.37%)大于OXA基因型检出率(14.56%)，而在哺乳仔猪群中，OXA基因型检出率(39.30%)大于TEM基因型检出率(30.53%)；其中豫南地区3个猪场OXA基因型检出率较高，且哺乳仔猪与母猪OXA基因型检出率差异较大，母猪OXA基因型检出率分别为44.44%(4/9)、1.92%(1/52)、18.33%(11/60),哺乳仔猪OXA基因型检出率分别为46.15%(6/13)、60.42%(29/48)、39.53%(17/43)。不同地区以及同一地区不同日龄猪群，产ESBLs大肠杆菌基因型存在差异，可能与不同地区以及同一地区不同日龄猪群使用的抗菌药不同有关[20]。不同基因型产ESBLs菌株间的耐药性差异需要进一步研究。

图4 河南省10个规模化猪场ESBLs菌耐药基因PCR检测情况

兽医临床上抗菌药的不合理使用，正在诱导、加剧多重耐药菌的出现，已经严重威胁到人类自身健康。猪场应该在兽医的指导下，依据诊断结果合理选择敏感的抗生素进行疾病防治，避免抗生素的不合理使用加剧耐药菌的出现。本研究表明，河南省规模化猪场广泛存在耐β-内酰胺类抗生素的大肠杆菌，且比2009年更加严重，提示我们在临床上需要选择更加敏感的抗生素进行ESBLS菌引起的疾病防治。