麻风康复者外周血Treg细胞及IL-10水平检测

丘文苑 林 笛 林悦芹 谢彩霞 蓝菲莹 谢龙凤 罗 权 张锡宝

麻风在组织学上以肉芽肿为特征，其反映着机体的免疫状态。在麻风患者中同时存在细胞免疫和体液免疫，但以细胞免疫为主[1,2]。CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞属于T淋巴细胞亚群，也叫抑制性T淋巴细胞，通过分泌具有下调作用的细胞因子发挥免疫调节、免疫耐受、免疫抑制作用。而IL-10在Treg细胞的分化及功能方面起着作用。目前，已有研究表明在麻风患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及血清IL-10比正常人明显增多[3,4]。但对麻风愈合的免疫状况研究却很少，我们通过检测麻风康复者外周血清中Treg细胞、IL-10，探讨Treg细胞、IL10在麻风康复者体内的免疫状况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本组患者为广东省泗安医院住院部休养员，共25例，其中男17例，女8例，年龄61～88岁，平均73.45岁，临床上均治愈。并选取同年龄层的健康志愿者20名为对照组，要求血清学及肝肾功能检查正常，排除感染结核、麻风、HBV、HCV、肿瘤及患自身免疫系统疾病的人群。

1.2 实验试剂与仪器 IL-10检测试剂盒(深圳达科)、RT-6000酶标分析仪、PerCP-抗人CD4 抗体、FITC-抗人CD25 抗体、PE-抗人Foxp3抗体、同型对照FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1、人Foxp3 BufferSet、缓冲液Stain Buffer(FBS)(美国Becton-Dickinson公司)、流式细胞仪(Beckman Coulter公司)。

1.3 实验准备 抽取每个实验者及对照组患者各2管5 mL肝素抗凝血。分离出其中1管的外周血单个核细胞，细胞浓度调至2×107个/mL。分为空白管、CD25同型对照管、CD4CD25管、Foxp3同型对照管、CD4CD25Foxp3管，在各管中加入100 μL细胞悬液。①分别在各管中加入CD4、CD25抗体，空白管不加抗体，充分混匀，4℃避光孵育30 min；②各管加入染色剂2 mL,1500 r/min离心5 min，重复洗涤2次，弃上清液；③各管加入穿膜剂1 mL,4℃避光孵育30 min,再加入穿膜缓释剂2 mL,1200 r/min离心5 min，重复洗涤2次，弃上清液；④在空白管中、CD25同型对照管、CD4CD25管中加入染色缓冲剂，充分混匀，避光待测;⑤Foxp3同型对照管、CD4CD25Foxp3管加入Foxp3抗体，混匀，4℃避光孵育30 min。再加入穿膜剂1 mL,4℃避光孵育30 min,；加入穿膜缓释剂2 mL,1200 r/min离心5 min，重复洗涤2次，弃上清液。最后加入染色缓冲剂;⑥将各管全部拿出上流式细胞仪检测。

1.4 Treg细胞检测 按照流式细胞仪检测方法，先上空白管，调节电压，并以CD25同型对照调节补偿，确定CD4+CD25+细胞群，再以CD4+CD25+细胞设门，以Foxp3同型对照确定其阳性信号，最后测定CD4CD25Foxp3管，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg细胞百分含量。

1.5 IL-10检测 采用Elisa法，按试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 CD4+CD25+Foxp3+Treg检测结果 利用流式细胞仪上的Cellquest软件对各组进行分析。见图1、2。麻风康复者组的CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg细胞百分含量明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

图1 麻风康复组CD4+CD25+Foxp3+Treg含量图2 正常组CD4+CD25+Foxp3+Treg含量

2.2 两组IL-10水平 麻风康复者组的外周血中IL-10明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平相关性分析 麻风康复的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相关性(r=0.561，P<0.05)；正常对照组中的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相关性(r=0.422，P<0.05)。

表1 各组CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10含量

3 讨论

麻风是由麻风分枝杆菌感染所致的一种传染病，与机体免疫功能有关。在接触相同数量的麻风杆菌，只有少数人发病。说明患者中存在不同程度的细胞免疫缺陷，而这些细胞免疫机制尚不明确。研究表明不同Th细胞亚群及其分泌的细胞因子功能紊乱在麻风发病发展中起着重要作用，免疫状态失衡可导致麻风患者促发和加剧病情变化。

CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞是一种具有免疫调节功能的T淋巴细胞，进入组织中会抑制自身免疫细胞，使机体形成一种免疫耐受，在一定程度上减少了自身免疫性疾病的发生，但也相应地减弱了机体对抗感染性病原菌。CD4+CD25+T淋巴细胞升高,意味着麻风康复者的抗感染能力减弱。

IL-10是一种抑制性炎症因子，主要是由Th2细胞、巨噬细胞、单核细胞及基质细胞等分泌，其主要功能是抑制Th1细胞，是抗炎症的重要细胞因子。在天然免疫中，IL-10通过抑制各种细胞(如巨噬细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞等)的分化、炎症因子释放来达到免疫抑制；而在获得性免疫中，IL-10通过抑制CD4+T淋巴细胞的增殖、细胞因子生成[5]。所以当IL-10水平升高，表明机体的抑制Th1细胞的功能增强，机体容易受到外来细菌、病毒、真菌等感染，从IL-10的来源说，IL-10可以有多种细胞分泌，但主要由Th辅助T细胞分泌。

Foxp3+是CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的抑制因子的启动子，可通过抑制因子的表达来发挥抑制作用，或通过抑制转录因子活性，从而负向调节细胞因子的表达。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表面存在能够表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原，对效应性细胞起抑制作用；或通过细胞直接接触机制或分泌IL-10等抑制细胞因子来抑制机体的免疫细胞的分化，对机体的免疫耐受和免疫应答具有重要作用[6]。过去的研究指出，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在麻风患者中明显高于健康对照组，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可能在麻风疾病的进程中参与重要的作用[7]。外周血IL-10水平虽不能完全作为Treg细胞的定量分析，但可作为Treg细胞定量分析重要辅助指标。Treg 细胞可分泌IL-10,而IL-10可促进Treg细胞分化。本研究结果中麻风康复组的CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+CD25+Treg数值均明显高于对照组(P<0.01)，同样外周血的IL-10水平也显著高于对照组(P<0.01)，能够侧面提示麻风康复者的免疫功能是有所下降的。Foxp3阳性的CD4+CD25+Treg细胞是机体具有负性免疫调节作用的T细胞亚群，临床检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞及IL-10水平对机体免疫功能的测定有一定意义。