miR-199a/mTOR在自发性高血压大鼠心肌纤维化和左心室肥厚中的作用机制研究

郝丹，周大亮，于熙滢，张春茹，魏林

左心室肥厚（LVH）是高血压常见靶器官损害之一，是高血压患者心血管事件发生和死亡的主要危险因素，约30%高血压患者合并有LVH[1]。研究表明，LVH的病理基础主要是心肌纤维化以及心肌肥大，因此抑制心肌肥大以及心肌纤维化对于治疗高血压心脏病具有积极的意义。微小RNA（miRNA）是一组长度19-25bp的内源性非编码小RNA，其可通过与下游靶基因的3’UTR区相结合，在转录水平对靶基因产生调控作用，从而参与一系列病理生理过程。近年来有研究显示， miRNA的表达失调或功能异常在心室肥厚的发生、发展中起重要作用，靶向miRNA可能作为诊断和治疗LVH的新型靶点[2]。动物研究表明，miR-199a在心肌肥厚大鼠中表达水平明显升高，可能参与其发生、发展过程[3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），是TargetScan预测的miR-199a靶基因之一，在心肌肥厚的发生中起重要作用[4]。然而，在高血压心脏疾病中，miR-199a和mTOR的表达及调控作用未见报道。本研究旨在探究miR-199a/mTOR在自发性高血压大鼠心肌纤维化和LVH中的作用及其机制，为高血压心脏疾病的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞 选取健康清洁级自发性高血压大鼠（SHR）30只与清洁级正常 WKY大鼠15只进行研究，均为12周龄，体重为200 g左右，动物许可证号为：SYXK(鲁) 2016 0025。所有动物均按照实验动物伦理委员会规定进行喂养。

H9c2心肌细胞购自中国科学院细胞库，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM培养基中于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2 仪器与试剂 ML-125动物血压测定仪购自于南京医用实验仪器有限公司；vibie E9型彩色多普勒超声仪购自于美国GE公司；7500型qRTPCR仪器购自于美国ABI公司；垂直电泳仪、转模仪、凝胶成像仪均购自于美国Bio-Rad公司；RNA提取试剂盒购自于天根生化科技有限公司；RT-PCR反应试剂盒购自于日本Takara公司；TaqMan miRNA反转录试剂盒购自美国Applied Biosystem公司；蛋白浓度测定试剂盒购自美国Solarbio公司；MiR-199a、mTOR PCR引物均由广州Invitrogen公司合成；mTOR、β-actin抗体购自于美国R&D公司；辣根过氧化物酶标记IgG、Lipofectamine 2000转染试剂盒购自于美国Jackson Immuno Resrarch公司；ECL显影剂购自于美国GEN-VIEW公司；miR-199a抑制剂购自百奥迈科生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 30只SHR大鼠根据随机数字表法分为SHR组（n=15）和抑制剂组（n=15）， 15只正常雄性WKY大鼠作为正常组（n=15）。正常组、SHR组：尾静脉注射等量生理盐水；抑制剂组：在SHR组基础上经尾静脉注射10 nM miRNA199a抑制剂20 μl，每周注射2次，连续注射4周。

1.3.2 超声心动图检测 腹腔注射10% 3 ml/kg水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠胸部毛发除净后进行左侧位固定，采用彩色多普勒超声诊断仪对左心室舒张/收缩末期内径（LVEDD/LVESD）、左心室后壁厚度（LVPWT）、室间隔厚度（IVST）进行测量，同时计算心肌缩短分数（FS）以及左心室射血分数（LVEF）。

1.3.3 血压检测 在大鼠安静清醒的状态下，使用尾动脉容积法检测大鼠血压，以收缩压作为观察指标（单位：mmHg）：将大鼠尾置于气囊内，逐渐升高气囊内压力压迫尾动脉，使血流不能通过。利用光电传感器探测末稍血流状态，当末稍血流停止时气囊内压力即为尾动脉收缩压。

1.3.4 左心室功能、左心室重量及左心室质量指数测定 大鼠腹腔麻醉后，右颈总动脉插管，导管从右颈总动脉插入后逆向进入左心室中，导管末端连接血压换能器，记录左心室压力最大升高或降低速率（+dp/dt，-dp/dt）、左心室舒张末期内压（LVEDP）。心功能指标测定结束后，断头处死大鼠，取出心脏先剪去周围大血管，吸干血液，再剪去心房和右心室游离壁，测定左心室重量（LVM），并计算左心室质量指数（LVMI），LVMI=LVM/体质量。称重结束后，将心脏组织保存于-80℃冰箱中进行后续研究。

1.3.5 心肌组织染色 HE染色：取出保存心肌组织，常规制备心肌组织石蜡切片，将石蜡切片置于二甲苯中固定30 min，随后在100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中各脱水5 min，水洗后滴加苏木素染色10 min，置于1%盐酸5 s后水洗。滴加伊红染液染色3 min，随后在75%、85%、95%、100%乙醇中各脱水2 min，滴加二甲苯透明处理，最后用中性树脂进行封片。显微镜下观察心肌组织变化，每张切片挑选5个清晰视野，统计视野中心肌纤维化情况，无心肌纤维化为0分，纤维化区域比例＜25%为1分，纤维化区域比例25%~50%记为2分，51%~75%记为3分，＞75%记为4分。

Masson染色：石蜡切片加入二甲苯进行脱蜡，在100%、95%、85%、75%乙醇中各脱水5 min后，流水清洗后进行铬化处理，滴加苏木精染色5 min，水洗后在盐酸中酸化5 s，再次水洗后滴加丽春红染液染色5 min，滴加2%冰醋酸进行清洗，置于1%磷钼酸中5 min，加入苯胺蓝染色5 min，滴加2%冰醋酸清洗后加入无水乙醇进行脱水处理，最后进行透明、封片。采用Metic Med 6.0软件计算心肌胶原纤维所占比例（CVF），CVF=胶原面积/总面积×100%

1.3.6 细胞转染 取对数期细胞，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染，将转染试剂、miR-199a阴性对照质粒、miR-199a mimis质粒分别转染至H9c2细胞，命名空白对照组、miR-199a阴性转染组、miR-199a过表达组，转染后置于37℃、5%CO2中培养48 h，随后收集细胞上清，进行后续测定。

1.3.7 荧光素酶报告基因测定 用miR-199a-mimic或miR-NC和psiCHECK2-mTOR1 3 "-UTR-Wt或psiCHECK2-mTOR 3 "-UTR-Mut分别共转染H9c2细胞。转染48 h后收集细胞，采用荧光酶素检测试剂盒检测其活性的变化。

1.3.8 实时定量PCR（ qRT-PCR） 采用RNA试剂盒从冷冻心脏组织及心肌细胞中提取总RNA，反转录为cDNA。采用qRT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应。反应体系为20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 uL，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反应程序：95℃ 30 s，95℃15 s，72℃ 15 s，共循环40次。以U6和GADPH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-199a和mTOR mRNA相对表达水平。

1.3.9 蛋白免疫印迹法（WB） 采用RIPA（Beyotime）裂解心脏组织和心肌细胞，裂解反应30 min，离心后收集上清液，提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，进行12%的SDSPAGE电泳，上样量体积含20 μg蛋白。电泳结束后将目的胶至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭转好的PVDF膜1 h，TBST溶液洗膜后，4℃摇床孵育稀释好的mTOR及内参β-actin抗体过夜，TBST清洗后加入二抗，室温下放置2 h，TBST清洗后ECL显色，置于凝胶成像仪中观察蛋白表达情况。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 21.0进行数据分析。计量资料以平均数±标准差（x±s）描述，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析；采用pearson相关性分析评估miR-199a与mTOR的相关性；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠左心室功能、室壁厚度的比较 三组大鼠LVEF、FS相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组相比，SHR组LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SHR组相比，抑制剂组LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 三组大鼠血压、左心室功能、质量分数测定结果比较 与正常组相比，SHR组收缩压、LVM、LVMI、LVEDP升高，+dp/dt、-dp/dt均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SHR组相比，抑制剂组收缩压、LVM、LVMI、LVEDP降低，+dp/dt、-dp/dt升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 大鼠左心室心肌胶原变化情况 HE、Masson结果显示，正常组小鼠心肌细胞形态正常，胶原纤维排列较整齐；SHR组心肌间质纤维排列疏松且出现明显纤维化，纤维增多、增粗；抑制剂组胶原纤维有所减少。与对照组相比，SHR组病理学评分、心肌胶原纤维比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SHR组相比，抑制剂组病理学评分、心肌胶原纤维降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1、表3）。

2.4 心肌组织中miR-199a、mTOR表达情况 与正常组相比，SHR组miR-199a mRNA表达升高，mTOR 的mRNA及蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与SHR组相比，抑制剂组miR-199a mRNA表达降低，mTOR的 mRNA及蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）（图2、表4）。

2.5 SHR大鼠心肌组织中miR-199a、mTOR相关性分析 Pearson相关性分析显示，miR-199a与mTOR 的mRNA和蛋白表达均呈显著性负相关（r=-4.873，P=0.000；r=-5.126，P=0.000）（图3）。

2.6 转染miR-199a后心肌细胞中miR-199a、mTOR表达情况 与空白对照组、阴性转染组相比，miR-199a过表达组miR-199a mRNA表达升高，mTOR的mRNA及蛋白表达降低，差异有统时左心室舒张功能下降与心肌纤维化及左心室肥厚密切相关。

表1 三组大鼠左心室功能、室壁厚度比较

表2 三组血压、左心室功能、质量分数测定对比

图1 心肌组织病理染色（100×）

表3 三组左心室心肌胶原情况比较

图2 心肌组织中 mTOR蛋白表达情况

表4 三组心肌组织中miR-199a、mTOR表达情况

图3 miR-199a、mTOR相关性分析

图4 转染后 mTOR蛋白表达情况

微小RNA（miRNA）是一组长度19-25bp的计学意义（P＜0.05）（图4、表5）。

2.7 荧光素酶载体活性检测结果 生物信息学库TargetScan与miRnada预测miR-199a与mTOR 3’UTR基因配对区域见下图5。在转染3’UTRWt的细胞中，与阴性转染组（2.23±0.85）相比，miR-199a过表达组组荧光素酶活性（1.07±0.37）显著降低（t=3.065，P=0.012）。而在转染3’UTR-Mut的细胞中，miR-199a过表达组与阴性转染组荧光素酶活性对比[（1.17±0.52）vs.（1.21±0.38）]，差异无统计学意义（t=0.152，P=0.882）（图5）。

表5 心肌细胞中miR-199a mRNA、mTOR 的mRNA及蛋白表达情况

图5 miR-199a与mTOR 3’UTR基因配对区域

3 讨论

高血压患者由于心脏负荷增加可导致心肌肥厚，随病变进展会出现心腔扩大并最终引起充血性心力衰竭。同时，心肌间质也会发生重建，主要表现为高血压心肌纤维化和左心室肥厚（LVH）。高血压左心室肥厚在宏观上表现为心室壁的增厚及心肌重量的增加，在组织学上表现为心肌细胞肥大和心肌纤维化。使心肌收缩、舒张僵硬度增加，从而导致心肌收缩、舒张功能的下降，还可导致心律失常，因此，抑制心肌肥大以及心肌纤维化对于治疗高血压心脏病具有积极的意义[5-7]。

SHR大鼠的高血压自发率为100%，此外，与人类高血压病十分类似，是目前研究高血压病发病机制和筛选降压药物较为理想的动物模型[8]。本研究结果显示，与正常组相比，SHR组LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均升高，结果提示SHR大鼠出现左心室肥厚，表明高血压心脏负荷增加与心肌肥厚的发生密切相关。进一步研究显示，与正常组相比，SHR组LVM、LVMI、LVEDP升高，+dp/dt、-dp/dt显著降低，说明SHR组大鼠左心室肥厚且舒张功能下降，与文献报道结果相似[9,10]。分析舒张功能降低的原因可能与心肌胶原纤维沉积有关，研究显示，SHR组大鼠心肌病理评分以及心肌胶原比例较正常组显著升高，表明SHR组大鼠心肌出现纤维化，与以往研究结果相似[11,12]。以上研究结果均提示，高血压内源性非编码小RNA，其可通过与下游靶基因的3’UTR区相结合，在转录水平对靶基因产生调控作用，从而参与一系列病理生理过程[13]。miR-199a主要在心肌组织中表达，研究显示，miRNAs通过调控心肌肥厚有关信号通路，从而在心肌肥厚发生、发展中起重要作用[14-17]。我们在SHR大鼠中的研究结果显示，与SHR组相比，miR-199a抑制剂组LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT、LVM、LVMI、LVEDP均降低，+dp/dt、-dp/dt显著升高，说明抑制miR-199a的表达后能够有效降低左心室肥厚，提示miR-199a可能参与高血压诱导的左心室肥厚的发生、发展。组织染色结果显示，抑制剂组大鼠心肌病理评分及心肌胶原比例均较SHR组降低，表明抑制miR-199a后能够有效抑制心肌纤维化，提示miR-199a可能与SHR大鼠心肌纤维化有关。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是在进化过程中相对保守的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过形成mTOR复合体1和mTOR复合体2在细胞生存、生长代谢、细胞增殖、细胞极性、蛋白合成、自噬及应激等方面发挥重要作用[18-20]。有研究显示，mTOR参与对Ⅰ型胶原的调控，因此在心肌纤维化中可能起一定的作用。本研究结果显示，与正常组相比，SHR组大鼠心肌组织中mTOR水平明显降低，而miR-199a抑制剂组mTOR水平明显升高。进一步进行相关性分析显示，miR-199a与mTOR呈显著性负相关。生物学预测发现，在mTOR mRNA的3’UTR中存在miR-199a作用的靶位点。为探究二者是否为靶向调控，本研究在体外心肌细胞中进行验证，荧光素酶报告基因结果显示，与miR-199a阴性转染组荧光素酶载体活性相比，miR-199a过表达组荧光素酶载体活性显著降低，说明miR-199a是靶向mTOR的调节分子之一，能够通过与mTOR的mRNA 3’UTR内的位点结合，下调mTOR基因表达。这些结果表明，miR-199a可能通过调控mTOR表达而参与SHR左心室肥厚、心肌纤维化的发生发展及病情演变。

综上所述，miR-199a表达上调可能通过调控mTOR参与SHR左心室肥厚、心肌纤维化的发生进展，推测miR-199a与mTOR可能是SHR左心室肥厚、心肌纤维化发生发展过程中的重要分子。然而，SHR心肌病变的发生机制极其复杂，miR-199a对mTOR的调控作用及其对疾病发生进展的具体调控机制还有待进一步深入探究。