TRIM24通过抑制EndoG核转移保护缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡

王沙，王惠君，黄晓燕，王宗超，宋宝国，吴娟

缺血性心肌病是指冠状动脉供血不足导致心脏损伤的一类疾病，是威胁人类生命健康的重大疾病[1]。而缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡是缺血性心肌病恶性进展的直接因素。TRIM24是TRIM家族中成员之一，也被称为转录中介因子1α（TIF1α）[2]。在细胞中，其主要通过直接结合多种核受体而正向或负向调控核受体下游基因的转录活性[3]。近年来，大量研究指出TRIM24在多种肿瘤发生发展中发挥促进作用[4-6]。进一步研究表明，TRIM24可能在细胞增殖、凋亡等生物进程中发挥重要作用。这些研究均暗示TRIM24可能具有保护心肌细胞凋亡的作用，然而目前仍没有关于TRIM24在缺血性心肌细胞凋亡中的研究。为此，我们针对TRIM24在心肌细胞凋亡中的作用进行了初步探究。我们首先建立了心肌细胞H9C2缺血再灌注损伤模型，并检测了TRIM24及凋亡相关分子的变化；进一步使用TRIM24过表达H9C2心肌细胞验证了TRIM24在缺血性心肌细胞凋亡中的作用。结果如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 H9C2心肌细胞来源于中国科学院上海细胞库，在实验室培养、传代、冻存。

1.1.2 实验试剂 DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；NotⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶（南京诺唯赞公司）；质粒小提试剂盒（天根公司）；Lipofectamine 2000转染试剂（ThermoFisher公司）；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；RIPA蛋白裂解液（生工生物）；BCA蛋白定量试剂盒（生工生物）；细胞核浆蛋白分离提取试剂盒（碧云天）；TRIM24抗体（ThermoFisher公司）；Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3、GAPDH、Histone3、EndoG抗体（CST公司）。

1.2 实验分组与缺血再灌注模型

1.2.1 实验分组 H9C2细胞培养在60 mm培养皿内，前期实验分为对照组（control）和缺血再灌注组（I-R），每组两盘，并独立重复三次实验。后期实验需要过表达TRIM24进行验证，设置三组：对照+Scramble组、I-R+Scramble组、I-R+ov-TRIM24组，每组两盘细胞，并独立重复三次实验。

1.2.2 缺血再灌注模型 H9C2细胞培养在P60培养皿内，待密度达到80%左右时进行缺血再灌注造模。H9C2细胞缺氧前将细胞培养基吸走，用PBS缓冲液液洗3遍，换成无糖DMEM培养液，放置于三期培养箱。 通入94%氮气、5%二氧化碳以及1%氧气的混合气，培养12 h，随后更换正常完全培养基，在5%二氧化碳细胞培养箱中培养4 h，完成H9C2心肌细胞缺血再灌注模型。

1.3 实验方法

1.3.1 TRIM24过表达质粒构建转染 将大鼠TRIM24基因CDS序列克隆至pCDH-CMV载体上，酶切位点为NotⅠ和EcoRⅠ，使用大肠杆菌DH5α对TRIM24过表达质粒转化扩增。使用Lipofectamine 2000转染试剂根据说明书转染TRIM24过表达质粒以及空白质粒Scramble到H9C2心肌细胞中，转染后24 h在对相应细胞进行缺血再灌注处理。

1.3.2 心肌细胞全蛋白提取 培养皿培养的单层H9C2心肌细胞，弃去培养基后用预冷的 PBS 缓冲液洗2遍，每盘加入200 μl的RIPA蛋白裂解液，用细胞刮刀将其刮下并收集到1.5 ml EP管中。使用超声破碎仪破碎细胞。12 000 g，4℃离心20 min，取上清到新的EP管中，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

1.3.3 核浆蛋白分离提取 培养皿培养的单层H9C2心肌细胞，弃去培养基后用预冷的PBS缓冲液洗2遍，根据细胞核浆蛋白分离提取试剂盒说明书逐步操作，分离获得细胞核和细胞质蛋白样品，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

1.3.4 Annexin V/PI凋亡检测 培养皿培养的单层H9C2心肌细胞，弃去培养基后用预冷的PBS缓冲液洗2遍，用600 μl 0.25%胰酶消化50 s，立即使用细胞培养基中和胰酶。将细胞吹下，并收集到1.5 ml EP管中。1000 rpm，4℃离心4 min，弃去上清， 收集细胞后用500 μl ×Binding Buffer重悬，每管取 100 μl用来双染。此外要设置空白组，FITC-Annexin V单染组，PI单染组。室温孵育15 min，使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测FL1和FL2通道荧光。

1.3.5 Western Blot检测蛋白表达 将蛋白样品配制成1×Loading Buffer蛋白溶液，根据定量结果上样40 μg蛋白量；使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白样品进行电泳分离；电泳结束后，用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，冰浴中100 V恒压转移1.5 h；2%BSA溶液封闭1 h；按说明书比例稀释一抗（TRIM24，BAX，BCL-2，Cleaved caspase 3，EndoG，Histone3，GAPDH）并过夜孵育；TBS-T溶液洗膜并孵育相应的二抗，室温下1 h；使用ECL发光液进行曝光成像。

1.3.6 统计学分析 本文采用 GraphPad Prism5 软件进行数据统计分析，计量资料采用（x±s）表示，两组之间的比较采用双尾t检验，多组之间的比较采用One-Way ANONA及Tukey校正，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡及TRIM24表达下降 相比于对照组（1.26±0.065），缺血再灌注模型可以诱导明显的心肌细胞凋亡（4.12±0.103，P＜0.001），同时检测凋亡相关蛋白发现促凋亡蛋白Bax（1.98±0.031，P＜0.05）、cleaved-caspase3（4.71±0.087，P＜0.001）的表达明显增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降（0.52±0.042，P＜0.05）；与此同时，我们也观察到TRIM24表达的明显下调（0.21±0.033，P＜0.001），这一结果暗示我们TRIM24可能具有抗凋亡作用。

2.2 过表达TRIM24可保护缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡 为了验证TRIM24可能具有的抗凋亡作用，我们在H9C2心肌细胞系中过表达TRIM24（图3A）后再进行缺血再灌注造模。利用流式细胞术检测心肌细胞的凋亡情况我们可以看到，相比于对照组（5.3±0.83%），缺血再灌注能诱导明显的心肌细胞凋亡（64.3±2.1%，P＜0.001）；而过表达TRIM24后能够显著降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡（11.4±0.97%，P＜0.001）。

图2 缺血再灌注诱导凋亡相关蛋白及TRIM24的表达情况

图3 过表达TRIM24可保护缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡

2.3 TRIM24通过调控线粒EndoG释放入核保护心肌细胞凋亡 为了探究TRIM24保护缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡的分子机制，我们进一步检测了凋亡相关基因的变化（图4）。相比于缺血再灌注组（BAX：3.2±0.21；BCL-2：0.41±0.032；cleaved caspase3：4.71±0.097），可以明显看到过表达TRIM24后能够明显的抑制BAX的高表达（1.08±0.031，P＜0.001）并增加BCL-2的表达（0.92±0.043，P＜0.05），但是对cleavedcaspase3的表达没有影响（4.93±0.104）。这一结果表明TRIM24可能通过BAX/BCL-2调控线粒体稳态来达到保护心肌细胞的目的。进一步，我们检测的线粒体内凋亡相关蛋白核算内切酶EndoG的核转移情况，结果可以看到相比于缺血再灌注组（7.64±0.113），TRIM24过表达后EndoG的释放入核显著下降（2.17±0.078，P＜0.001），进而阻止了缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。

图4 TRIM24对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3的影响

图5 TRIM24调控线粒体稳态及EndoG释放入核

3 讨论

三结构域（TRIM）蛋白家族包含一个保守的RBCC结构域（RING-B-box-coiled-coil），目前在多细胞动物中已知超过60个家族成员[2]。TRIM蛋白超家族组成大多数E3泛素连接酶，在许多蛋白分子的翻译后修饰中发挥着关键作用[7]。尽管TRIM蛋白超家族在心脏中的表达水平很高，但它们在心脏中的功能仍不明确。其中，一些TRIM超家族蛋白分子TRIM63、TRIM55以及TRIM54，也被分别称为MuRF1、MuRF2、MuRF3，它们特异性表达于心肌和骨骼肌[8,9]。这些TRIM超家族蛋白分子会通过泛素-蛋白酶体依赖性通路降解肌节蛋白（如肌球蛋白，肌钙蛋白Ⅰ）及肥大信号因子（如PKC，SRF及IGF-1等），进而调控心肌生长发育及其功能[6,10]。而且，最近研究表明TRIM63、TRIM55蛋白编码基因的突变会造成心肌细胞内蛋白降解通路紊乱，进而导致肥厚性心肌症[11-13]。在本次研究中，我们终点关注TRIM24。最近很多研究发现TRIM24在癌症发生发展中的关键作用。TRIM24会与肿瘤蛋白p53直接作用，通过泛素化导致p53降解，进而影响到基因组稳定性、细胞循环周期以及细胞凋亡[2]。此外，TRIM24还作为多个基因的转录中介因子或转录激活子发挥作用，其不仅可以通过与多个核受体相互作用发挥功能，也可以与组蛋白H3直接作用并调控基因甲基化水平[6]。TRIM24已成为多种肿瘤发生发展的一个重要标志物。然而TRIM24在心脏中的作用仍未阐明。

近年来，虽然在心血管疾病的预防、检查和治疗方面都有了很大进步，但其仍是世界上发病率和死亡率的一个主要因素[14]。缺血性心脏病是由于动脉阻塞引起心肌血液供应减少导致的。一般情况下，心肌缺血会导致氧气、营养物质供应不足以及有毒物质积累[1,15]。及时的血流恢复可以减少心肌损伤及死亡率。然而，在临床上，血流的恢复经常会导致额外的心肌损伤及并发症，被称为缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡是缺血性心脏病恶性进展的关键因素[16,17]。在之前的研究中，TRIM24在细胞凋亡中发挥着重要的调控作用。为此，我们设计此次研究用以探究TRIM24在缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡中的作用。

本研究利用H9C2心肌细胞系构建细胞缺血再灌注模型。我们利用流式细胞术及凋亡相关蛋白表达水平检测，实验发现缺血再灌注明显诱导心肌细胞凋亡增加。与此同时，我们检测到TRIM24的蛋白表达水平在缺血再灌注处理后明显降低。因此，我们猜测TRIM24可能具有抗心肌细胞凋亡的作用。

为了进一步验证，我们通过过表达TRIM24确认其抗凋亡作用。流式细胞术结果显示TRIM24过表达能够明显降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。为了探究其中具体的分子机制，我们检测了凋亡相关蛋白变化情况，结果显示TRIM24过表达能明显抑制BAX表达并增加BCL-2表达，但cleaved-caspase3没有明显变化。BAX和BCL-2在维持线粒体稳态中发挥着重要作用[18-20]，这一结果指出TRIM24抑制的心肌细胞凋亡可能不是通过caspase级联进行的，而是通过线粒体内凋亡相关蛋白的释放进行的。为此，我们检测了线粒体内凋亡相关蛋白核算内切酶EndoG的核转移情况，实验结果表明TRIM24过表达可以显著抑制EndoG的核转移，进而保护缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。

综上所述，本研究首次阐明了TRIM24在缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡中的作用及分子机制，即TRIM24通过调控BAX/BCL-2表达改善线粒体稳态，进而减少线粒体内凋亡相关蛋白EndoG的核转移，最终显著缓解缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。本研究为缺血再灌注诱导的心肌损伤的预防、治疗提供了新的靶点与理论基础。