不同利福平血药浓度对肺结核患者免疫功能的影响

李明瑛，牛文一，姚恒波，席秀娥，王 霞

0 引言

肺结核是临床常见的肺部慢性传染性疾病，流行病学调查显示，近年来，其发病率及死亡率均呈升高趋势。肺结核多因结核分枝杆菌感染引起，飞沫传播为主要传播途径，常累及肺脏，多发生在成人，病程长，易复发[1]。世界卫生组织在阻止结核策略中提出了该病标准化疗方案，复治涂阳肺结核者每日化疗方案为3HRZE/6HRE，即强化期3个月异烟肼(Isoniazid，INH，简称H)、利福平(Rifampin，RFP，简称R)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA，简称Z)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB，简称E)四药联用，巩固期6个月H、R、E三药联用，能取得较为满意的临床效果[2]。其中，利福平作为开发较早的利福霉素类半合成广谱抗菌药，较异烟肼、链霉素而言，其杀灭结核菌活性更强，具有高效、半衰期延长、抗耐药等特点，疗效确切，目前已成为抗结核的主要药物[3]。然而，有报道，由于患者药物代谢率不同，导致不同患者应用同等剂量药物后疗效与不良反应差异明显；其中，利福平个体血药浓度差异若较大，治疗效果则不尽相同[4]。因此，本文主要探究不同利福平血药浓度对肺结核患者免疫功能的影响，旨在为复治涂阳肺结核免疫治疗提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用随机平行对照方法纳入2014年5月至2017年5月于我院收治的接受3HRZE/6HRE常规化疗方案治疗的86例肺结核患者为研究对象，开展前瞻性研究。抽取患者清晨静脉血2 ml，采用高效液相色谱法(HPLC)检测利福平血药浓度，结果为5.55～11.26 mg/L，中位值9 mg/L，按照所有患者利福平血药浓度中位值高低将其分为2组，其中观察组54例，利福平血药浓度9～11.26 mg/L；对照组32例，利福平血药浓度5.55～8.99 mg/L。本研究获我院医学伦理委员会批准，两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

1.2 纳入标准 ①符合《肺结核诊断和治疗指南》[5]中相关诊断标准，伴有发热、胸痛、咳嗽等症状，涂片或培养、痰液检查见(或未见)抗酸杆菌，X线检查提示存在肺部病灶；肺部病理组织检查提示存在典型结核小结；②抗结核治疗前肝功能正常；③近2年内未接受免疫抑制剂治疗；④年龄≥18岁，复治涂阳肺结核者，即初治失败、规则用药满疗程后痰菌复阳、慢性排菌或不规则化疗>1个月的肺结核患者；⑤患者对本研究知情且签署同意书。

1.3 排除标准 ①合并病毒性肝炎、自身免疫型肝炎、酒精性肝病、低氧血症、充血性心力衰竭、菌血症等可引起肝功能异常的疾病；②伴糖尿病、艾滋病、长期应用激素等；③合并精神病及癫痫病史者；④过敏体质或对本研究药物过敏者；⑤妊娠期或哺乳期妇女。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法 行3HRZE/6HRE治疗。强化期，维持3个月。异烟肼(沈阳红旗制药有限公司，国药准字H21022350，规格0.1 g/片)0.3 g/次，qd；利福平(广东华南药业集团有限公司，国药准字H44020771，规格0.15 g/片)0.45 g/次，qd；吡嗪酰胺(成都锦华药业有限责任公司，国药准字H51020877，规格0.25 g/片)1.5 g/次，qd；乙胺丁醇(杭州民生药业有限公司，国药准字H33021602，规格0.25 g/片)0.75 g/次，qd。巩固期，维持6个月。异烟肼0.3 g/次，qd；利福平0.45 g/次，qd；乙胺丁醇0.75 g/次，qd。

1.4.2 利福平血药浓度检测方法 所有患者每日按时按量口服抗结核药物，于第7天清晨空腹服药后2 h采集肘静脉血2 ml，置入乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetracetic acid，EDTA)抗凝管，于低温高速离心机(德国Eppendorf)内以3 000 r/min速度离心10 min，吸出上清液后装入1.5 ml冻存管内，置于液氮罐储存。采用Agilent 1260型高效液相色谱(美国Agilent)，以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇∶水(70∶30)为流动相，流速为1 ml/min，检测波长为340 nm，测定利福平血药浓度。利福平标准品购自大连美仑生物技术有限公司。

表1 两组患者一般资料比较(例,%)

1.4.3 免疫细胞检测方法 在治疗前后采集患者外周静脉血5 ml，留取乙二胺四乙酸抗凝血标本，血浆离心后置入-80 ℃冰箱冷冻保存。采用FACSCalibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，测定机体免疫细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比及调节性T细胞(Regulatory cells，Treg)、骨髓来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)水平。异硫氰酸酯荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗CD3抗体、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)标记的CD4抗体及MDSC标记抗体PE-CD11b、FITC-CD33、APC-HLA-DR，均由Beckman Coulter公司生产。Treg细胞标测试剂盒购于美国Thermo scientific公司。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.4 血清炎性因子检测方法 使用UniCel DxI 800全自动化学发光免疫分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，以双抗体放免分析法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，以酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清C-反应蛋白(CRP)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)水平，试剂盒均购自上海碧云天生物有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 细菌学检测方法 于治疗前留取患者痰涂片3次，每次结果呈阳性。治疗过程中每月复留取痰涂片，直至治疗结束。痰菌转阴率判断：参考《中国结核病分类法》[6]，连续2个月痰菌培养为转阴未复阳者。

1.5 观察指标 观察两组血清炎性因子TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平，对比免疫功能指标CD4+、CD8+、Treg、MDSCs百分比及CD4+/CD8+比值，并分析强化期结束时、治疗结束时及结束后1个月痰菌转阴率。比较两组不良反应发生率。

2 结果

2.1 两组血清炎性因子水平比较 观察组治疗后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均显著低于治疗前及对照组治疗后(P<0.05)，见表2。

2.2 两组免疫功能指标比较 观察组治疗后CD4+、CD4+/CD8+水平显著高于治疗前及对照组治疗后(P<0.05)，Treg细胞、MDSCs水平显著低于治疗前及对照组治疗后(P<0.05)，CD8+水平与治疗前及对照组治疗后比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.3 两组痰菌转阴率比较 观察组强化期结束时、治疗结束时及结束后1个月痰菌转阴率均显著高于对照组(P<0.05)，见表4。

表2 两组血清炎性因子水平比较

注：与治疗前比较，*P<0.05;与对照组比较，#P<0.05

表3 两组免疫功能指标比较

注：与治疗前比较，*P<0.05;与对照组比较，#P<0.05

表4 两组痰菌转阴率比较(例，%)

2.4 两组不良反应观察 两组未见严重不良反应发生，肝肾功能检查无异常，观察组1例轻度恶心、呕吐，可耐受，未经干预后自行缓解。两组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

有报道，复治涂阳肺结核患者免疫功能紊乱是引起其复发及细菌扩散的关键原因[7]。目前，复治涂阳肺结核患者多采用3HRZE/6HRE方案治疗，其中利福平作为一线抗结核病首选药物之一，静脉注射0.5 h后血药浓度可达最高峰，药物广泛分布于全身，直接参与血液循环，具有广谱杀菌功效，能有效抑制宿主细胞中细菌大量繁殖[8]。但由于个体间血药浓度差异较大，尤其合并肝脏损伤的结核病患者更为明显，既往经验剂量已难反映其临床疗效[9]。对此，笔者主要立足于利福平血药浓度角度，探究其与肺结核患者免疫系统缺陷的相关性，旨在指导临床治疗。

本研究结果显示，观察组治疗后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均明显低于治疗前及对照组治疗后，证实利福平血药浓度升高可有效降低复治涂阳肺结核患者机体炎症因子水平。研究表明，活动性肺结核患者在抗结核治疗中，其血清促炎因子(如IL-6、IFN-γ等)呈现动态变化，与患者病情发展、预后转归存在直接关系[10]。具体而言，TNF-α为多功能炎性细胞因子，能有效激活IL-6等炎性因子释放，促进内皮素生成；CRP属于非特异性炎性标志物，当心肌细胞缺血缺氧性损伤出现时其浓度会持续升高，在诱发血管炎症、促进血栓形成中具有重要作用；IL-6为促进炎症反应类因子，多由成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等产生，能诱导CRP生成，引起血小板聚集，促使炎症细胞聚集、黏附及新生内膜生成，加快机体对炎症反应速度；IL-10为抑制炎症反应类细胞因子，能诱导CD4+T细胞及CD8+T细胞活性下降，抑制细胞介导的相关免疫应答[11]。有报道，伴随着肺结核病灶范围的逐渐增大，空洞出现，患者机体免疫功能明显下降，易遭受结核分枝杆菌侵袭，引起肺组织破坏，出现肺部炎症反应，导致炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-10等大量分泌[12]。利福平属于利福霉素类抗结核药，脂溶性较好，能达到较高的组织血浆浓度比值，血药浓度升高，可更好地调节促炎及抗炎细胞因子水平，抑制炎症渗出，减少炎症介质释放，改善炎症递质及患者血液动力学，减轻组织病理损伤，起到免疫抗感染作用[13]。

本研究结果显示，观察组治疗后CD4+、CD4+/CD8+水平明显高于治疗前及对照组治疗后，且Treg细胞、MDSCs水平明显低于治疗前及对照组治疗后，证实利福平血药浓度升高可有效改善复治涂阳肺结核患者免疫功能。有报道，T淋巴细胞介导的免疫应答反应与肺结核病情进展、恢复存在一定关联，很大程度上免疫损伤会促使受抑结核分枝杆菌再次活跃，并重新侵入机体进行繁殖，致使病灶恶化进而发病[14]。而谢永国等[15]通过监测老年患者体内利福平浓度水平并对其药代动力学特征进行研究，发现利福平血药浓度对肺结核患者机体免疫水平存在一定的影响。T细胞免疫有中心调控作用，能反映机体细胞免疫状态，其中CD4+T细胞属于辅助性淋巴细胞，能促进多种细胞因子大量分泌，增强细胞免疫反应，与NK细胞具有协同作用；CD8+T细胞包括抑制性T细胞与杀伤性T细胞，二者会引起免疫应答抑制效应，促使可溶性抑制因子大量分泌，经分泌穿孔素或直接杀伤作用将感染细胞杀死；CD4+/CD8+比值为评估患者细胞免疫功能的关键参考指标，若CD4+/CD8+比值下降，则提示细胞免疫失衡，表明患者免疫功能低下[16]。而Treg细胞能抑制Th1细胞免疫反应，减少IFN-γ分泌，抑制机体免疫应答。胡群英等[17]通过检测结核病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平，结果显示，与健康对照者比较，肺结核患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量明显增加，并证实其能抑制PBMC及CD4+CD25+T细胞对BCG的增殖反应及细胞因子的分泌，促使Th1细胞免疫反应受抑，表明其在结核免疫中具有重要作用。而MDSC属于一群免疫抑制性细胞，在外伤、炎症等病理状态下，其数量明显升高，能抑制免疫细胞应答，诱导Treg形成，间接抑制机体免疫应答。有报道，在不明显改变用药安全性前提下，需增加利福平用药剂量，促使其血药浓度高于最低抑菌浓度，从而提高其杀菌及抑菌活力，增强疗效[18]。笔者认为，高浓度利福平能有效杀灭结核分枝杆菌，调节T淋巴细胞发育、分化及成熟，并修复受损T淋巴细胞，活化CD4+T、CD8+T细胞，抑制TNF-α、CRP、IL-6、IL-10等炎症因子，促进机体免疫功能恢复。

本研究结果显示，观察组强化期结束时、治疗结束时及结束后1个月痰菌转阴率明显高于对照组，证实利福平血药浓度升高可有效提高复治涂阳肺结核患者痰菌阴转率。有报道，感染部位组织中的药物浓度与药物疗效密切相关，为确保组织中能达到有效治疗浓度，药物血药浓度应达到致病菌最低抑菌浓度的2倍及以上[19]。药物必须在病灶部位达到足够浓度，才能杀灭或抑制组织深部潜伏的致病菌，而药物进入组织中的浓度与局部血流量、药物理化特性、血浆蛋白结合率等因素相关[20]。利福平血药浓度升高，具有双重抗菌机制，能杀灭代谢旺盛期及静止期结核菌，结合依赖DNA的RNA多聚酶β亚单位，可抑制细菌RNA合成，预防该酶与DNA连接，阻断RNA转录过程，诱导DNA及蛋白合成停止，增强临床疗效[21]。本研究显示，两组不良反应发生率比较差异无统计学意义。利福平不良反应以消化道反应为主，一般可耐受，本研究未见严重不良反应出现，提示利福平安全性较高，而不同血药浓度未见显著差异，可能与样本量较小有关。需要注意的是，本研究仍存在一些不足之处，如样本量偏小，干预时间较短，未涉及安全性研究，故今后需开展高质量、多中心、大样本研究，旨在为临床治疗提供更为可靠的依据。

综上，不同利福平血药浓度对肺结核患者免疫功能存在一定影响，临床上应给予足够重视。