姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的制备及制剂学性质分析

王彬辉，邹 杰，章文红，李范珠，高晓宇，陈 玲，郭曼曼，叶晓莉*

0 引言

姜黄素(Curcumin,Cur)是一种多酚类化合物[1]，研究发现，其抑制肝肿瘤细胞是通过诱导肿瘤细胞调亡、改变细胞受体连接等实现的[2-3]。然而，姜黄素在水中溶解度极低，且姜黄素的浓度越高对细胞的毒性越大，药物在体内代谢迅速，故限制了姜黄素的临床应用[4]。

纳米粒具有靶向作用，可提高药物的溶解度、延长药物在体内的作用时间等特点[5-7]。本实验以姜黄素为模型药物，以聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)为载体材料，通过正交实验筛选最佳处方工艺，制备具有肝靶向的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒，为构建姜黄素纳米粒的载药系统提供实验基础。

1 仪器与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；JEM-1200EX透射电子显微镜(日本Jeol公司)；Optima超速低温离心机(美国Beckman公司)；Mill-Q超纯水器(美国Millpore公司)；Nano-ZS型粒径分析仪(英国Malvern公司)；HJ-6B多头磁力加热搅拌机(金坛市金伟实验仪器厂)。

姜黄素对照品(含量98.8%，批号：110823-201004，中国食品药品检定研究院)；姜黄素原料药(含量>98%，批号：12041502，成都普思生物技术有限公司)；甲醇(色谱醇，德国Merck公司)、乙腈(色谱醇，德国Merck公司)；聚乙二醇-聚己内酯(山东岱罡生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 姜黄素含量测定

2.1.1 姜黄素对照品溶液的制备 取姜黄素对照品10.00 mg，甲醇溶解，并定容到100 ml，作为姜黄素对照品溶液。

2.1.2 色谱条件[8]色谱柱：Thermo Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：2%醋酸-乙腈(46∶54)；流速：1.0 ml/min；检测波长：260 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。

2.1.3 专属性考察 取姜黄素对照品溶液、空白聚乙二醇-聚己内酯纳米粒和姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒，考察其专属性，结果见图1，色谱峰专一、灵敏，且峰形良好，姜黄素的保留时间约为11.3 min。

图1 高效液相色谱图

2.1.4 标准曲线的建立 精密量取姜黄素对照品溶液，制备系列浓度的姜黄素样品溶液50.00、20.00、10.00、5.00、2.00、1.00 μg/ml，用HPLC测定，得标准曲线方程：Y=42.31X-26.61，r=1(n=6)。

2.1.5 精密度试验 制备质量浓度分别为4.97、9.97、19.81 μg/ml的姜黄素对照品溶液，同一天内用HPLC测6次，日内精密度RSD符合要求(<2%)。

2.1.6 方法回收率试验 制备质量浓度为16.00、20.00、24.00 μg/ml的含处方量辅料的姜黄素溶液，测定方法回收率。结果见表1。

表1 方法回收率(n=6)

2.1.7 稳定性试验 制备质量浓度为20.00 μg/ml的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒样品溶液，考察样品稳定性(12 h内)，结果显示，RSD为0.75%，表明姜黄素在12 h内测定稳定。

2.2 姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的制备 有机相(A相)：取姜黄素和聚乙二醇-聚己内酯，溶于二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶剂中；水相(A相)：取泊洛沙姆188，溶于水中。把A相与B相混合，超声，制得初乳；再制备一份泊洛沙姆188的水溶液，把初乳滴加此水溶液中，继续搅拌直到挥去有机溶剂和部分水，得到姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒溶液，此溶液呈黄色乳光。

2.3 指标考察

2.3.1 形态学考察[9]常温下，取一定量的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒，滴于铜网上，用滤纸吸干溶液，再把质量浓度为2.0%的磷钨酸溶液滴于铜网上，等自然挥干后，观察纳米粒的形态。

2.3.2 纳米粒粒径测定 制备姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒溶液，加入到样品池中，用粒径分析仪测定，记录数据。

2.3.3 纳米粒包封率与载药量测定 精密量取一定量的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒溶液，置于离心管中，封口，低温超速离心(40 000 r/min，45 min)后，取上清液，微孔滤膜(0.22 μm)滤过，称重，记W1。取姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒溶液1 ml，甲醇定容至10 ml，微孔滤膜(0.22 μm)滤过，计算1 ml姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒溶液中的药物总含量，记W0。聚乙二醇-聚己内酯和姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒中姜黄素的质量之和，记Wt。包封率=(W0-W1)/W0×100%，载药量=(W0-W1)/Wt×100%。

2.4 姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒最佳处方工艺 在预实验基础上，共选择4个因素：因素A为有机相与内水相体积比、因素B为乙酸乙酯与二氯甲烷体积比、因素C为内水相表面活性剂浓度、因素D为聚乙二醇-聚己内酯用量，按L9(34)正交试验，筛选处方工艺。

2.5 体外释放度测定 采用动态透析袋法考察姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的体外释药特性，释放介质为含有20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)。分别称3份含1 mg姜黄素的姜黄素对照品和姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒，用2 ml 20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)释放介质溶解，得到的溶液置于预先处理过的透析袋(Mw=3 500)中，再把透析液放入250 ml 20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的释放介质内，(37±0.5)℃水浴振荡(振荡速度75 r/min)，按一定时间点各取样1 ml，取样后立即补加1 ml的20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)释放介质，微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液测含量，计算累积释药率(Q%)。

3 结果

3.1 正交试验 把粒径、包封率和载药量3个指标按系数积分分配数值：粒径(F1)的系数积分为30%、包封率(F2)的系数积分为35%、载药量(F3)的系数积分为35%。综合评分值(F)=F2/91.33×30+(1-F1/163.4)×35+F3/5.49×35。结果见表2、表3。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验设计和结果

表4 方差分析

由表3可知，D因素对纳米粒的制备影响最大，其次分别为C和A，而B因素的影响最小。由表4可知，因素C、因素D显著影响姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的制备。根据表3和表4，确定了姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的最佳处方工艺为A3B1C1D2。

3.2 最佳工艺验证 按正交实验得到的最佳处方工艺制备3批纳米粒，测粒径、多分散系数、包封率、Zeta电位和载药量，结果显示，粒径为(102.84±2.68)nm，多分散系数为0.11±0.01、包封率为84.36%±1.19%，Zeta电位为(-0.29±0.11)mV，载药量为4.70%±0.27%。见表5。姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒呈圆形或类圆形，粒子间未见黏连，结果见图2～图4。

表5 最佳工艺验证结果

图2 姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒透射电镜照片

图3 姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒粒径分布

图4 姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒Zeta电位

3.3 体外释放试验结果 在20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的释放介质中，释药曲线见图5，结果显示，2 h累积释药超过80%，表明姜黄素原药在20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的释放介质中释药较快。而姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的体外释放缓慢：2 h累积释药不足35%，10 h累积释药70%左右，直到48 h累积释药超过85%。根据药物体外释放模型，拟合释药行为，结果分别为：Higuchi模型=14.472t1/2+12.343(r=0.925 7)、一级动力学模型ln(1-Q)=-0.046 3t+4.208 8(r=0.870 1)、零级模型Q=1.752 2t+31.219(r=0.772 5)、Weibull模型lnln(1/1-Q)=0.727 5 lnt-1.439 5(r=0.994 0)，表明姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒在释放介质中释药行为符合Weibull方程。

图5 姜黄素溶液和姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒释放曲线(n=3)

4 讨论

本实验采用乳化溶剂挥发法[10]制备了姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒，预实验中曾选择有机相为丙酮、丙酮与乙醇的混合溶剂，但制备得到的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒粒径、多分散系数、包封率均较小；当选择有机相为二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷的混合溶剂时，制备得到的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒粒径、多分散系数均较大，也不合适。选择有机相为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶剂时，制备得到的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒包封率、载药量都较高，且较稳定，故本实验选择二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶剂为有机相。

因聚己内酯在体内具有良好的生物细胞相容性和降解性，常用作缓控释制剂的载体[11-12]，但聚己内酯亲水性较弱，在制备纳米粒时，药物容易吸附在聚己内酯的表面，通过聚乙二醇修饰聚己内酯，使得聚己内酯的亲水性提高，改善材料的疏水性与降解性。本实验结果表明，聚乙二醇-聚己内酯载体材料的用量对纳米粒的稳定性影响较大：一定范围内(50、100、150 mg)，随着聚乙二醇-聚己内酯用量的增加，姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒的粒径、多分散系数变大，包封率增加，但当使用量达到200 mg时，制备的姜黄素聚乙二醇-聚己内酯纳米粒易破损而沉淀。

姜黄素为水难溶性药物，为了使得姜黄素在体外释放介质中溶解，可在释放介质中加入表面活性剂[13]，达到漏槽条件。本实验分别在释放介质中加入十二烷基磺酸钠、tween-20和乙醇等表面活性剂，考察十二烷基磺酸钠、tween-20和乙醇对姜黄素释放度的影响。结果表明，在含十二烷基磺酸钠(浓度5%)或tween-20(浓度5%)的PBS缓冲液(pH 5.8)中，姜黄素的累积释放度均不符合漏槽要求，而在含乙醇(浓度20%)的PBS缓冲液(pH 5.8)累积释放度符合漏槽要求，故选择含20%乙醇的PBS缓冲液(pH 5.8)为释放介质。