HPLC法测定磺丁基醚-β-环糊精中杂质β-环糊精的含量

李闻新，张 余，部 实，张福林

0 引言

磺丁基醚-β-环糊精(Betadex sulfobutyl ether sodium，SBE-β-CD)是20世纪90年代由美国Cydex 公司开发成功的β-环糊精(β-CD)衍生物[1]，能与药物分子包合形成非共价复合物[2]，提高药物的溶解度和稳定性。与β-CD相比，SBE-β-CD具有水溶性好、肾毒性低、溶血作用小等优点，已广泛用于药物新包合物的研究[3-7]。SBE-β-CD是由1,4-丁烷磺内酯与β-CD发生取代反应得到的，由其合成工艺可知，β-CD是制备原料之一，所以控制SBE-β-CD中β-CD的含量是其质量控制的重要因素。目前仅一项研究报道了SBE-β-CD中β-CD的含量测定方法[8]。该方法采用高效液相色谱-示差折光检测器，分析时间近30 min。本研究采用蒸发光散射检测器，并优化色谱条件，将分析时间缩短至10 min内，明显提高了分析效率，建立了β-CD含量测定方法。该方法灵敏准确、简便快捷，为SBE-β-CD质控标准的建立奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2420 型蒸发光散射检测器(沃特世科技有限公司)。

1.2 试药β-CD对照品(中国药品生物制品检定所，纯度>98%，批号：100317-201203)，SBE-β-CD供试品 (批次：20131104、20131105、20131106，由我院中心实验室提供)；甲醇为色谱纯(SK chemicals)；水为超纯水。

1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(10∶90)；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；ELSD参数：漂移管温度为70 ℃，气体(N2)压力为30 psi，进样量为10 μl。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液 精密称取β-CD对照品23.47 mg，用水溶解，定容到100 ml量瓶中，得浓度为0.234 7 mg/ml的标准溶液。

1.4.2 供试品溶液 精密称取样品约385 mg，用水溶解，定容到25 ml量瓶中，得浓度约为15 mg/ml的样品溶液。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性试验 分别取“1.4”项下的对照品溶液、供试品溶液、二者的混合溶液和空白溶剂，按“1.3”项下色谱条件分别进样，记录色谱图。

1.5.2 线性和范围 精密量取对照品溶液适量置10 ml量瓶中，逐级稀释得浓度为0.078 23、0.117 4、0.156 5、0.195 6、0.234 7 mg/ml的系列溶液，按“1.3”项下色谱条件进样测定，以峰面积(Y)对β-CD浓度(C)进行线性回归。

将对照品溶液逐步稀释并进行测定，以信噪比S/N=10和S/N=3时各对照品的量为定量限和检测限。

1.5.3 精密度和重复性 于SBE-β-CD溶液中加入适量β-CD对照品，平行制备5份，测定含量，计算RSD，考察方法的精密度。精密吸取β-CD对照品溶液10 μl，重复进样6次，计算β-CD峰面积的RSD，考察仪器重复性。

1.5.4 稳定性试验 取β-CD标准品溶液，分别在0、4、8、12 h进行测定，记录峰面积，计算RSD，考察其稳定性。

1.5.5 回收率试验 于SBE-β-CD溶液中加入适量β-CD对照品，按供试品溶液的制备方法，平行制备6份，测定β-CD含量并计算回收率。回收率按如下公式计算：(测得量-样品中含量)/加入量×100%。

1.6 供试品含量测定 取3批SBE-β-CD供试品，按“1.4.2”项下制备供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件进样10 μl，记录色谱图和峰面积，以标准曲线法计算供试品的含量。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 β-CD和SBE-β-CD的保留时间分别为9.512 min和2.013 min，所用试剂及SBE-β-CD供试品对β-CD的测定均无干扰(见图1)。

2.1.2 线性和范围 β-CD在0.078 23～0.234 7 mg/ml的浓度范围内线性关系良好，线性方程：Y=1.674 7 X+3.593 2，r=0.994 7。β-CD的定量限和检测限分别为0.078 23、0.045 40 mg/ml。

2.1.3 精密度和重复性 β-CD精密度的RSD为3.4%，表明该方法精密度良好。见表1。重复性试验结果RSD为4.6%，见表2。

2.1.4 稳定性 β-CD在4个时间点浓度的RSD为2.4%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。见表3。

表1 精密度试验结果

图1 专属性色谱图

表2 重复性试验结果

表3 溶液稳定性试验结果

2.1.5 回收率 β-CD的平均回收率为105.8%，RSD为4.8%，表明该方法的准确度良好。见表4。

表4 回收率测定结果

2.2 含量测定 3批次SBE-β-CD供试品中均未检测到杂质β-CD。

3 讨论

3.1 检测器的选择及参数的优化 由于β-CD及其衍生物SBE-β-CD是一类环状低聚糖，在紫外区域内没有吸收，所以无法用紫外检测器进行检测，只能使用通用型检测器。有文献报道，用示差折光检测器检测β-CD，也能达到比较高的灵敏度[8]，但该方法分析时间长达30 min，严重影响检测效率。蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种通用型质量检测器，其针对糖类的检测已经有不少报道[9-10]，但对β-CD的检测国内还未见报道，本研究通过优化色谱条件，在提高分析效率的同时取得了较理想的分离效果。

漂移管温度和载气压力是ELSD的2个重要参数[11]，漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比上升，但温度过高，可能导致分析物部分气化，信号强度变小，雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响到检测器的响应，信噪比随流速的增加而升高，由于本实验使用的是低温型ELSD，所以漂移管温度设为70 ℃即可使流动相完全蒸发，达到理想的分离效果。ELSD的响应取决于被分析物颗粒的数量和大小，在ELSD载气的压力对信号的影响很大。载气压力太低会形成大量的微粒，从而导致尖峰信号或噪声信号。当载气压力太高时，微粒量会下降，导致信号强度降低，本实验使用N2作为载气，最终气体压力定为30 psi，此时可达到最小的噪声信号，色谱图基线平稳。

3.2 流动相比例的优化 由于相关文献较少，本研究借鉴了低聚糖的色谱条件[12-13]，并结合专属性试验进行了色谱条件的优化。本实验在40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%范围内考察不同比例的甲醇水溶液作为流动相的情况，结果显示，甲醇在流动相中比例增大可有效改善峰形，有利于组分的基线分离，但甲醇比例增加不利于SBE-β-CD和β-CD的溶解，β-CD保留时间也明显缩短，最终使SBE-β-CD和β-CD分离度降低。当增加流动相中水的比例时，有利于组分的分离，但水的比例过大，不利于流动相在漂移管内的气化，使基线噪声增大，从而导致分析灵敏度降低，综合考虑分离效果、分析时间等因素，选择甲醇-水(10∶90，v/v)二元混合流动相。

3.3 结论 本研究建立的HPLC-ELSD方法能准确、快速地检测SBE-β-CD中β-CD的含量，且该方法简单易行、专属性强，可用于SBE-β-CD质量控制的研究。