色谱分析发展简史及其给我们的启示

刘虎威, 傅若农

(1. 北京大学化学与分子工程学院, 北京 100871; 2. 北京理工大学, 北京 100081)

1 色谱分析方法的出现[1]

文献记载,有些科学家在19世纪下半叶就观察到了吸附现象[2,3],如1850年龙格(F. F. Lunge)观察到将一滴染料混合物溶液滴到吸墨纸上时会扩散成一层层的圆形环;申拜恩(C. F. Schoenbein)在1861年注意到,如果把一滴无机盐混合溶液滴在一张滤纸上,那么各种盐分会以不同速度向四周扩散;德伊(D. T. Day)在1897年、克利特卡(S. K. Kritka)在1900年初发现把石油简单地通过碳酸钙的细粉柱,就会分离为不同馏分。这些工作可以说是平面色谱或者柱色谱的萌芽,但直到20世纪初,人们只是利用吸附现象实现了简单的分离,今天看来,其原理基本都属于前沿色谱或顶替色谱。进入20世纪后,人类社会的发展对科学技术提出了更高的要求,科学家需要在分子层面上实现复杂混合物的分离分析,乃至分离制备。完成这一历史贡献的是俄国的植物学家米哈伊5西蒙诺维奇5茨维特(Michael Semenovich Tswett)(见图1)。正是这位杰出的科学家在20世纪初系统地研究了色谱分离现象,并认识到这种分离方法的重要性。

图 1 (从左到右) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)Fig. 1 (From left to right) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)

关于茨维特的生平及色谱的早期发现过程有不同的版本,但大同小异。不过,有些中文版本(包括网上资料)存在某些不符合事实的表述。20世纪90年代初,苏联著名色谱学者K. I. Sakodynskii教授(见图1)和美国耶鲁大学L. S. Ettre教授(见图1)对色谱发现的历史进行过深入研究,我们在这里仅根据他们的严肃考证[4,5]来简述色谱的初期发展历程。

茨维特1872年5月14日生于意大利的阿斯蒂(Asti),他父亲是俄国外交官,当时在瑞士工作,母亲是意大利人,在茨维特出生后便去世。茨维特13岁前生活在瑞士洛桑,后随其父到日内瓦,1891年从日内瓦学院(College of Geneva)毕业后进入日内瓦大学(University of Geneva)学习,并于1893年获得物理与数学系的学士学位。而后转学植物学,1896年获得细胞生理学博士学位。随后回国与其父团聚于克里米亚半岛,1896年底迁居到圣彼得堡,开始在俄罗斯帝国科学院(the Imperial Russian Academy of Sciences)的植物实验室工作。由于俄罗斯不承认他的瑞士学位,茨维特必须在俄罗斯再次攻读(在职)博士学位。随后他谋得一个植物学私人教职,工作于P. Lesgaft的生物实验室。1900年其父在雅尔塔去世。茨维特于1901年通过题目为“叶绿素的物理化学研究”的学位论文答辩,获得喀山大学(University of Kazan)的硕士学位。1901年10月他在圣彼得堡召开的第11届俄国自然科学家与医生协会大会上发表了“叶绿素生理学研究的方法和任务”的报告,并于年底作为实验助理进入波兰华沙大学工作。

1903年茨维特成为华沙大学的助理教授并在波兰其他大学讲授植物学课程。是年3月,他在华沙自然科学家协会的生物学会议上作了关于“新吸附现象”的报告,第一次公布了他的色谱研究结果。1906年3月他给德国的植物学刊物“the Berichte der Deutschen Botanischen Geselschaft (德国植物学报告)”投了两篇关于色谱的重要学术论文,1907年5月在柏林举行的一次德国植物学会会议上,他系统介绍了色谱技术,并展示了分离得到的纯色素。是年8月他受聘为华沙兽医研究所的讲师,后与波兰女子Helena A. Trusevich结婚。1908年10月成为华沙工学院(Polytechnic Institute of Warsaw)化学与采矿系的资深讲师,这期间他完成了俄罗斯博士学位论文“动物和植物界的叶绿素”,并于1910年在华沙出版(30年后此书对Kuhn的研究工作起了重要作用), 1910年11月在华沙大学通过了博士学位论文答辩。这期间他于1909年底的第12届俄国自然科学家与医生协会大会上宣读了题为“分析色素混合物的物理新方法及其在叶绿素研究中的应用”的报告,全面阐述了色谱分离方法。

1911年底,茨维特在莫斯科参加了普通和应用化学Mendelew大会,作了题为“叶绿素化学的现状”的报告,同年还获得俄罗斯帝国科学院的M. N. Akhmatov奖。1914年位于西西伯利亚的托木斯克大学(University of Tomsk)聘请他为植物学教授,但被他以气候不适的理由拒绝。1915年夏他偕妻子离开华沙去俄罗斯敖德萨,期间德国军队占领了波兰,他无法返回华沙,便暂居莫斯科。此时波兰一些高校迁徙到莫斯科,他便加盟华沙工学院。1916年8月他在迁移到诺夫哥罗德的华沙工学院继续教学工作,后因健康原因在高加索山区休养。1917年3月爱沙尼亚塔尔图大学(University of Tartu)聘请他为植物学教授和植物园主任,他随即于9月到塔尔图开始其教学和科研工作。1918年8月德国军队进犯塔尔图后,他随俄国教授们迁徙到沃罗涅什,1919年6月26日因喉部慢性感染而病故于沃罗涅什,终年47岁。其妻子则于1922年病逝于黑海东岸的格列博夫卡。二战期间茨维特的坟墓被毁,直到1992年人们才在1919年埋葬他的地方(Okata-Alekseevsky寺院)立了一块墓碑。值得一提的是,1918年有几位著名科学家曾推荐茨维特作为诺贝尔化学奖候选人[6],但最后没有颁给他。而到1919年这位色谱之父就辞世了,这令后来的很多色谱学者为之感叹(事实上,1919年没有颁发诺贝尔化学奖)。

图 2 (a)1906年和(b)1908年茨维特发表的色谱装置和 色谱图示意Fig. 2 (a) Illustration of the chromatographic device published by Tswett in 1906 and (b) a chromatogram in 1908

由上可知,茨维特于1901年(甚至更早一些)在试验中观察到了色谱现象,这在其硕士学位论文中有所描述,并在俄国国内学术会议上做了有关报告[7]。当时,茨维特在一根玻璃管的底部塞上一团棉花,在管中填入粉末状吸附剂,例如碳酸钙等,然后把该吸附管与吸滤瓶连接,把有色植物叶子的石油醚萃取液倾注到管内的吸附剂上面,然后用纯石油醚洗脱,植物叶中的几种色素就在管内形成不同种颜色的色带(见图2)。此时,茨维特对吸附分离的认识仍然没有超出前人的认识,只是观察得更为仔细和系统,这可以认为是现代色谱的萌芽。1903年在华沙国际学术会议上用俄文发表的分离叶绿素的研究结果[8]更详细地描述了实验装置和分离过程,他采用了109种有机和无机吸附剂来分离叶绿素等色素,并讨论了吸附材料和淋洗过程对吸附分离的影响。在这篇论文中,茨维特第一次认识到一种新的色谱类型,即洗脱色谱,并且用光谱方法检测了分离后的物质。尽管由于人们至今不知道的原因,登载该论文的俄文会议录直到1905年出版,且在此论文中没有出现“色谱”这个词汇,但K. I. Sakodynskii坚持认为,1903年3月8-21日应该作为色谱分析方法的诞生日。

1906年茨维特在德文刊物上正式发表两篇有关液-固色谱的学术论文[9,10],文中第一次提出了“Chromatographie”,英译名为Chromatography,即“色谱法”的概念(中文也曾译作“层析法”或“色层法”)。这个词是由希腊语中“颜色”(chroma)和“书写”(graphein)这两个词根组成的,因此,有人在英语中将色谱称作“color writing”[11]。茨维特实验方法中的玻璃管就是“色谱柱”,碳酸钙就是“固定相”,纯净的石油醚就是“流动相”。图2是茨维特分别于1906年和1908年发表的色谱分离装置和色谱图。由于20世纪初世界的科学中心在德国,只有用德文发表的论文才可能被大部分科学家所阅读。因此,当时西方很多顶级学者正是通过这两篇文章了解了色谱,故他们认为色谱的出现应该是1906年的事情。这也就导致了色谱发现年份的不同说法,即1901年说、1903年说和1906年说;也因为如此,进入21世纪后人们用了5年多的时间来纪念色谱发现100周年。波兰化学会的分析化学家于1994年9月在华沙大学生物学楼的墙上挂了一块纪念牌,上面用波兰语写着铭文为(译作中文) “M. S. Tswett博士于1901-1908年在此建筑内发现了色谱”。

2 色谱分析方法的发展[12]

茨维特发现的色谱在科学上有重大意义,但并没有立即得到当时化学界的重视。原因是多方面的:第一,茨维特是植物学家,他的研究工作主要在植物学界交流,其他领域的科学家不容易了解到;第二,他的工作开始以俄文发表,而当时科学的中心在德国,德文被认为是国际科学语言(正如今天科学的中心在美国,英文是国际科学语言),这就使得国际科学家没有及时了解到色谱这一技术;第三,当时的茨维特不是一位著名的科学家,所以难以获得科学界知名人物的关注和支持,即使当时的植物学界也有一些著名的科学家对茨维特的色谱方法持否定态度;第四,当时的科学技术及社会经济的发展对分析分离(separation,即分子水平的分离)还没有迫切的需求,一般的制备分离(即isolation,主要是蒸馏和萃取方法)就能满足要求了。因此,尽管在茨维特之后也有一些科学家使用了色谱方法进行化学物质的分离,但并没有引起科学界的广泛注意。

直到1931年,著名的奥地利裔德国化学家R. Kuhn及其合作者E. Lederer使用了茨维特的液-固色谱法,用碳酸钙吸附剂填充的玻璃管(内径1 cm,长度15cm)对来自蛋黄的30 mg叶黄素样品经过3次分离,得到了3种胡萝卜素异构体,即α-胡萝卜素(mp 188 ℃)、β-胡萝卜素(mp 184 ℃)、γ-胡萝卜素(mp 178 ℃),从而证明蛋黄叶黄素是氧化胡萝卜素的混合物,同时也证明了茨维特的方法可以实现快速有效的分离(有关Kuhn等人的这部分研究工作,文献[13]有详细而有趣的描述,有兴趣者可以参阅)。有必要指出,Kuhn生于维也纳,1922年在维也纳大学获得化学博士学位,其导师为1915年的诺贝尔化学奖得主R. Willstätter教授(此人当年对茨维特的色谱方法是持否定态度的,他将茨维特1910年出版的书给了其学生Kuhn, Kuhn又交给其学生Lederer,他们从书中学到了色谱技术)。1925年Kuhn受聘于慕尼黑大学,1938年因为其在胡萝卜素和维生素方面的研究而获得了诺贝尔化学奖(颁奖时间为1939年,当时德国政府要求其弃奖,但他还是在二战之后领了奖)[13]。如此著名的化学家采用了色谱方法,得到了极其重要的研究结果,很快就为科学界所熟知,从而使色谱获得了“重生”,进入了飞快的发展阶段。有人做过统计[11],迄今为止的诺贝尔化学奖得主中有超过12位科学家的获奖工作是与色谱分不开的。

就在Lederer和Kuhn的上述工作之后,Kuhn实验室的H. Brockman[14]和A. Winterstein[15]也采用色谱方法很快获得了重要成果。瑞士的P. Karrer等[16]和匈牙利的L. Zechmeiister等[17]著名学者也发表了色谱应用的论文,这些都对色谱的发展起了重要的推动作用。1937年Springer出版社就出版了第一本德文色谱专论[18], 1938年出现了新的色谱类型----薄层色谱(TLC)[19]。

以上讨论的是液-固吸附色谱的早期发展,气-固色谱又如何呢?事实上,1904年的诺贝尔化学奖得主W. Ramsay在1905年就利用活性炭的吸附性质成功分离了复杂的气体混合物[20],这应该是气-固色谱的萌芽。20世纪40年代初,有3组科学家同时研究气体吸附色谱。首先是G. Hesse在1941-1942年采用装有淀粉的玻璃管分离了氮气中的溴和碘[21],后来又用硅胶填充柱和二氧化碳流动相分离了一些脂类化合物以及共沸物和顺反异构体[22];很可惜,他的有关研究因二战而中断了。再就是G. Damkǒhler和H. Theile分离了载气流中的甲醇-乙醇混合物以及环己烷和苯的混合物,他们还将甘油涂在吸附剂上以降低吸附活性(这应该是最早的气-液色谱尝试)[23]。第三组科学家是E. Cremer及其学生A. Kunte等人,他们研究了乙炔加氢的动力学并分析了乙炔和乙烯的混合物。Cremer的学生F. Prior则采用Kuhn在1947年开发的简单色谱装置,用炭黑作为固定相分离了空气中的二氧化碳[24]。Cremer的另一个学生Microchem则分离了氮气、乙烯和乙炔,采用的是热导检测器[25]。Cremer和她的学生在二战期间还设计制造出第一台气-固色谱仪。基于这些史实,Sakodynskii教授[26]认为,气-固色谱的发明人应该是G. Hesse和E. Cremer。有趣的是,Cremer的第一篇气-固色谱论文于1944年投送给Naturwissenschaften杂志,经修改后该杂志于1945年2月录用了这一论文。然而,正当出版社准备以特刊付印时,印刷工厂在空袭中被炸毁,所以这篇文章就葬身于废墟之中,直到31年后的1976年才作为历史文件而发表。

瑞典科学家A. W. K. Tiselius(见图3)对色谱的发展也做出了重要贡献,他和S. Claesson在20世纪40年代初对色谱方法进行了分类[27,28],这种分类法一直沿用至今。Tiselius最为人知的是其电泳研究成果,他因发明了分离蛋白质的电泳装置而获得了1948年的诺贝尔化学奖。当然,电泳一直是色谱的姐妹技术,一般也包含在色谱的范畴。其实,Tiselius实验室还有一个重要贡献,即发明了液相色谱(LC)的梯度洗脱方法。

图 3 (从左至右)A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)Fig. 3 (From left to right) A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)

分配色谱的发明要归功于英国的化学家A. J. P. Martin和R. L. M. Synge(见图3)。Martin生于伦敦,1932年从剑桥大学毕业后进入物理化学实验室,此后他发展了采用氯仿-水的液-液多步萃取系统以分离维生素E。研究中他想到将对流中的两种液体之一固定下来,而让另一种流动,这就把萃取和色谱联系了起来。1936年获博士学位后,Martin和Synge一起用对流分配的方法分离氨基酸。他们把用水饱和的硅胶装填在30 cm长的柱管中,用氯仿做流动相,将乙酰氨基酸加到柱上,同时加入甲基橙来监控氨基酸在柱管中的移动。他们得到的分离效率远远高于当时任何复杂的装置,这就是1940年分配色谱的发明[29]。很有趣的是,多年后Martin回忆当年的研究工作时,写到[13]“这一工作比科学更神奇,我们当时根本不理解我们做的是什么”。为了从理论上解释色谱分离过程,他们发展了色谱的塔板理论。此后,Martin和Condsen又发展了二维纸色谱[30]。

在Martin的第一篇色谱论文[29]中,作者就预言气体也可以作为分配色谱的流动相,但当时无人对此感兴趣。直到十年之后Martin和A. T. James一起实现了自己的预言。他们采用涂敷了苯基甲基硅油(含10%的硬脂酸)的Celite颗粒装填在40 cm的柱管中,成功分离了甲胺以及其他有机酸,从而发明了气-液分配色谱[31]。这一成果发表于1952年,非常巧合的是,Martin和Synge分享了1952年的诺贝尔化学奖。当然,获奖理由是他们在1941年前后对分配色谱的贡献,而不是1950年气-液色谱的发明。

此后,气相色谱(GC)进入了快速发展期,在高速发展的石油化工行业迅速得到了应用。1957年英国人M. J. E. Golay[32]开创了开管柱(open tubular column)GC,习惯上称为毛细管(capillary)GC,这是GC发展史上具有里程碑意义的技术创新。1979年弹性石英毛细管柱的出现使毛细管柱GC迅速普及,今天市场上85%以上的GC柱是这种柱型。可以说,20世纪50-70年代色谱领域GC的发展由于其强大的分离能力而独领风骚,而LC的发展则相对缓慢一些。原因之一是GC、特别是毛细管柱GC技术满足了这个时期石油化工发展对分析检测的需求,也为日益受到重视的环境保护检测提供了技术支持;二是当时工业的发展对LC的要求相对不那么迫切;三是LC的发展受到技术上的限制,尽管理论研究表明,细内径色谱柱和小颗粒填料是提高LC分离效率的关键,但小颗粒填料的制备技术尚未成熟,同时,填料粒径减小所导致的高压也是当时仪器所难以承受的。

在理论方面,1956年荷兰学者J. J. Van Deemter等[33]在Martin等人的塔板理论的基础上发展了描述色谱过程的速率理论,美国犹他大学的J. C. Giddings教授总结和扩展了前人的色谱理论,从1955年开始研究色谱的分子动力学理论[34], 1965年出版了专著《Dynamics of Chromatography》[35],该书至今仍然被学术界认为是色谱的经典,这为色谱的进一步发展奠定了理论基础。他于1991年出版的著作《Unified Separation Science》[36]更是推动了整个分离科学的发展。Giddings对分离科学的发展还有两项重要的贡献,一是发明的类似洗脱色谱的场流分级(field-flow fractionation, FFF)技术[37],二是从1965年开始作为执行编辑出版Elsevier的定期系列综述《Advances in Chromatograph》直到1993年。1996年他因癌症而逝世,享年66岁,被学界认为是分离科学领域的重大损失。

在LC方面,1956年E. Stahl[38]系统地研究了硅胶的规格、性能、薄层厚度等对分离效果的影响,并研制出薄层色谱板涂布器,从而使TLC得到了广泛应用。柱色谱从茨维特的经典LC到现代高效液相色谱(HPLC)则是20世纪60年代后半期的事情。GC难以直接分离高沸点强极性的化合物,虽然有些被分析物可以经过衍生化处理或裂解后用GC分析,但增加了方法的复杂性,而经典LC采用玻璃管装填直径为100 μm左右的填料,流动相主要依靠重力驱动通过色谱柱,一般需要几个小时甚至几天完成一次分离,时间长,分析效率低。从塔板理论到速率理论都证明,由于气相分子扩散系数比液相大4～5个数量级,故要实现LC的高效分离,就需要小粒度填料和细内径色谱柱。另一方面,传统的气-固吸附色谱难以分离强极性混合物,而制药工业的发展以及生命科学的发展却非常需要能够分离水溶液中极性化合物甚至生物大分子的方法。为此,20世纪60年代有一批科学家专注于研究提高LC分离效率和拓展应用范围的问题,从而发展了粒度在40 μm以下的填料,并采用高压输液泵迫使流动相通过色谱柱,这就是HPLC,或者称为现代LC[39]。

对HPLC发展有重要贡献的首先是耶鲁大学的Cs. Horváth教授团队。Horváth(1930-2004)出生在匈牙利,毕业于布达佩斯工学院(Budapest Institute of Technology)的化工专业。1956年匈牙利政治动乱中他到了西德,开始在一家公司工作。此后于1961年进入J. W. Goethe University攻读博士学位。1963年进入哈佛医学院(Harvard Medical School)做博士后,开始GC方面的研究,开发了载体涂渍开管柱(SCOT)。而后他受聘于耶鲁大学,于60年代中期开发了粒径为30～40 μm的色谱填料,并设计制造了世界上首台HPLC仪器[40]。他也是最早使用反相HPLC的科学家,深入研究了反相HPLC的保留机理。还使用顶替色谱进行制备分离,后来在毛细管电泳(CE)和毛细管电色谱(CEC)方面也有建树,对生命分析化学的发展做出了重要贡献。

杜邦公司的研究团队在小颗粒填料方面做了开创性的工作,如P. Hamilton[41]在1960年就用小粒径的离子交换树脂很好地分离了氨基酸,J. Kirkland等人在60年代中期开发了粒径为30～40 μm的硅胶填料Zipax[42],并且涂覆了β,β′-氧二丙腈作为液-液色谱固定相。这种固定相稳定性差,固定液流失严重,柱寿命也就一两天,且不能进行梯度洗脱。这迫使他们转向高分子材料,先后开发了Zipax SCX、Zipax SAX和Zipax HCP 3种很受市场欢迎的填料。Zipax SCX很适合药物分析,但当时美国食品药品监督管理局(FDA)还不认可HPLC方法。Zipax SAX后来成为第一个被FDA认可的填料,Zipax HCP则适合于分离所有疏水性化合物。在此期间,Kirkland基于硅化学方法开发了键合相[43],获得了专利授权的Zipax Permaphase键合固定相,其中Permaphase ODS (C18)成为HPLC的经典填料,流行至今。从20世纪60年代后期到70年代早期,其他实验室也开发了类似的填料,如Waters公司的Corasil I和Corasil II、Merck公司的Perisorb等,都对HPLC的发展起了重要作用。然而,此时的填料比表面很低(1～10 m2/g),导致对很多物质的保留作用太弱而不能分离。后来Kirkland团队又开发了著名的Zorbax全多孔硅胶填料,最早的粒径为7 μm,孔径6 nm(60 Å),比表面积达到300 m2/g,色谱性能大为提高。因此可以说,HPLC的发展史很大程度上就是填料技术的进化史,表1列出了不同年代的填料粒径变化情况。

表 1 HPLC填料粒径的发展变化Table 1 Development of particle size for HPLC

由表1可见,填料粒径的减小直接导致柱压力的升高,这对仪器的耐压性能提出了更高要求。1960年中期Kirkland团队采用装配气动放大泵的820型仪器,通过硅橡胶隔垫密封的注射器进样。由于压力高,几次进样后就会漏液,一般几个小时就要更换密封垫。后来,他们开发了数字混合梯度装置和带样品环的进样阀,使得HPLC仪器性能大为提高。Waters公司在商品化的HPLC仪器方面起了非常重要的作用。此外,对HPLC发展有重要贡献还有L. R. Snyder、I. Halász和B. Karger等人,这里不再一一介绍。总之,HPLC的出现是一批科学家在60年代后期到70年代初期共同研究的结果。

20世纪70年代后期色谱的发展进入了GC和HPLC并驾齐驱的时代,GC越来越趋于成熟,色谱-质谱(MS)联用技术、特别是基于毛细管柱的GC-MS技术得到了普遍应用;HPLC的发展也加快了速度。因为在自然界已知的化合物中约15%可以用GC直接分析,而其余85%基本都可以用LC分析,所以,HPLC的发展越来越受到重视,特别是生命科学和生物制药的快速发展,更使HPLC成为不可或缺的分离分析方法。到20世纪90年代后期,J. W. Jorgenson等[44-46]致力于开发粒径小于2 μm的HPLC填料,他们称之为超高压LC,即UPLC。近几年他们又在研发1.1 μm的UPLC填料[47,48]。需要指出,2004年Waters公司推出了基于亚2 μm填料色谱柱的超高效LC仪器,并将UPLC注册为专利产品名称。随后其他公司也相继推出商品化的超高效LC仪器,名称有超高效液相色谱(UHPLC)或超高流速液相色谱(UFLC)等。也有人对HPLC、UPLC和UHPLC作了重新定义[49],我们将在其他文章中详细讨论。

随着HPLC的飞速发展,LC-MS技术也取得了突破。获得2002年诺贝尔化学奖的电喷雾技术逐步成为LC-MS/MS的标配接口。同时,又出现了一些新的分离分析技术。主要是20世纪80年代初由Jorgenson等[50,51]在Hjertén等[52,53]的工作基础上发展起来的毛细管区带电泳(CZE),由S. Terabe等[54]发展的胶束电动色谱(MEKC),以及90年代出现的集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱(CEC)[55],构成了较为完整的CE分离模式。到90年代后期,基于整体材料的HPLC和CEC受到广泛重视[56],随后又出现了芯片技术的快速发展,开始叫作微全分析系统(μTAS)[57]或者芯片实验室(lab-on-chip)[58],后来统称为微流控学(microfludics)[59],现在发展成为微纳流控(micro/nano-fludics)技术[60]。另一方面,超临界流体色谱(SFC)经历了20世纪90年代的较快发展和随后十来年的相对停滞,近几年又有了新的进展,从样品制备中的超临界流体萃取,到生物分析、食品分析和药物分析的SFC,以及制备SFC都展现了良好的应用前景[61]。

在应用领域,2000年6月人类基因组计划的提前完成[62]在很大程度上得益于分析化学家发展的阵列毛细管电泳(ACE)技术[63]。从此,人类进入了功能基因组(后基因组)时代,科学家的研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。基因组DNA的测序结果还不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后修饰等问题,而这些问题可望在转录组学、蛋白质组学、糖组学、脂质组学和代谢组学等生命组学研究中找到答案。这也是目前色谱和电泳及其与MS的联用技术最重要的应用领域。生命科学、环境科学、材料科学和新能源研究都是色谱相关技术可以发挥更大作用的领域。

3 色谱分析方法的现状和未来

色谱法在100多年的发展过程中,各种方法的发展是不平衡的。LC出现虽然早,但GC是最早广泛应用于工业生产的技术。之所以如此是因为GC的分析灵敏度高,分离效率高,分析速度快,分析精度高,很好地满足了当时科学研究和社会发展的需求。后来HPLC突飞猛进,是基于小粒度填料和高压输液泵的技术突破,同时也是制药工业和生命科学的发展使然。目前,GC和HPLC是世界上应用最广的分析技术,在食品安全、石油化工、生物医药、环境保护、材料科学等领域发挥着极其重要的作用。将来的发展趋势是仪器的自动化、网络化,特别是计算机技术和人工智能的应用,以及专门的进样装置及样品预处理装置与色谱仪器的一体化,比如顶空进样、吹扫捕集进样、固相微萃取(SPME)、超临界流体萃取(SFE)和加压溶剂萃取(PSE)等技术已经实现了与不同色谱仪器的在线联用。GC-MS迅速普及,全二维GC、多维LC以及二维CE的发展也引人注目,它们将对复杂混合物的分析发挥重要作用。HPLC近年在生命科学领域的应用发展很快,其中较为活跃的是离子色谱(IC)、疏水相互作用色谱(HIC)、手性分离及反相色谱与其他模式结合的多维色谱。HPLC应用面广,可以进行制备分离,在生命科学和医药领域中有很好的应用前景。HPLC的仪器市场将持续增长,主要表现在LC-MS系统以及LC-NMR系统的进一步成熟和应用范围的扩大,以及开发更为简单高效的仪器系统,包括各种新的MS技术。据中国行业研究报告网最新研究报告显示,到2022年全球色谱仪器市场总规模将达109.9亿美元[64]。

著名色谱学者G. Guiochon在1998年发表文章[65]认为,GC和HPLC是分离分析领域极为成功的范例,而SFC和FFF发展缓慢,CE则处于前途未卜的状态。关于SFC, Giddings和Myers早在20世纪60年代就发表了先驱性的研究工作,80年代初期毛细管柱SFC是一个研究热点,而且当时认为SFC将掀起分析方法的革命,但是后来各大仪器公司纷纷停止了SFC的生产,放弃了进一步开发SFC的计划。毫无疑问,SFC具有一些独特用途,兼具GC和LC的一些优点,但是它也只能在GC和HPLC的夹缝中生存,而GC和HPLC已成为广泛应用的技术,这就造成了SFC市场有限的局面。值得注意的是,近年来SFC又有东山再起之势[66],特别是在手性药物分离、生命分析化学和组学分析领域,SFC的多样品适用性、快速分离和流动相绿色环保的特点逐渐被人们所重视。采用压缩CO2流动相、亚2 μm填料的填充柱SFC的文献越来越多[67]。SFC与UHPLC分离可以在一台仪器上实现,这被沃特世公司称为超高效合相色谱(ultra performance convergence chromatography, UPC2)[68]; SFC与HPLC构成的二维分离系统展示出优于一般二维HPLC的分析速度和分离效率,有望应用于更多的研究领域[69]。为此,几个大的仪器厂商,如安捷伦、沃特世、赛默飞世尔和岛津等公司又都推出了各自的SFC仪器,预示着这一技术可能有很好的市场前景。

20世纪80年代兴起的CE因具有惊人的高柱效和相对简单的仪器设备而吸引了许多分析化学家参与研究,特别是MEKC和CEC的出现,使许多色谱学者觉得CE似乎要解决绝大部分分离问题。然而,进入21世纪以来,许多工业分析化学家逐渐对CE失望了,原因是CE的分析重现性和检测灵敏度达不到HPLC的水平,这大大阻碍了其实际应用。同时,很多CE研究人员转移到了由微通道电泳发展而来的微纳流控研究领域,致使CE的发展相对停滞了,有些仪器厂商已经停止了CE仪器的生产。目前,CE的主要应用领域是基因测序(阵列CE)、手性药物分离、物化参数(如解离常数)的测定以及相互作用研究等领域。最近采用CE分离表征纳米材料,研究纳米颗粒的性质及其与其他分子的相互作用取得了很好的效果[70]。而各种纳米材料如金属有机骨架(MOFs)、磁性和非磁性纳米颗粒、碳纳米管和石墨烯在CE中的应用也取得了很好的进展[71],这可能是一个很有前途的CE发展方向。在常规分析领域,虽然CE的分析重现性已经在很大程度上得到了解决,在生物大分子分析中也显示了其优越性,但由于毛细管内径只有25～75 μm,光学检测器的灵敏度仍然是一个瓶颈问题。基于纳米孔的新一代基因检测技术的出现有望取代阵列CE,而微纳流控的发展又会进一步缩小CE的发展空间。因此,除非CE在进一步提高分析重现性的同时发展出更高灵敏度的通用检测技术,解决一些其他方法解决不了的问题,否则,其发展前景并不令人乐观。

FFF也经历了长时间的发展,但应用仍然有限。FFF是根据颗粒物质在各种场中的扩散速度不同而实现分离的,故主要用于颗粒物如合成与天然高分子的分析,也可以分离细菌、病毒、微生物和脂质体等生物颗粒。目前,FFF的主要应用领域还是聚合物分析[72],采用热FFF可以表征共聚物的自组装[73]。近年来纳米科技的发展为FFF提供了一个新的机遇[74],不对称流FFF的应用越来越多[75],在纳米药物分析方面展现了独特的优势[76],比如,不对称流FFF与电感耦合等离子体质谱联用可以分析金属纳米颗粒。这是一个FFF可以展示其优越性的领域,可能推动FFF的进一步发展。总之,基础研究产生的新方法能否得到广泛的应用,从而推动技术进步和社会经济的发展,主要取决于这种方法是否能解决其他方法所不能解决的实际问题,是否具有已有方法所不具备的优点,以及是否有适当的市场需求。

4 色谱发展史给我们的启示

总结色谱100多年的发展史,给我们的启示主要是:第一,基础研究始终是科学技术进步的源泉。没有茨维特当初对色谱分离这一物理现象的仔细观察,没有Martin等人对分配色谱理论的系统研究,没有Giddings对色谱理论的深入阐述,很难想象色谱的发展能有这么快。第二,社会经济发展的需求是各种分析技术创新的驱动力。无论是色谱的出现,还是当初Kuhn等人分离胡萝卜素的工作,都是科学研究对分离技术的需要才导致了色谱的发展;至于20世纪50年代GC突飞猛进的发展,则是石油化工对分析技术的迫切需求所致。而20世纪90年代以来生命科学和医药事业的发展以及环境科学的发展更是为新的色谱技术提供了强大的驱动力。第三,学科交叉是分析技术创新的重要途径。茨维特是植物学家,Martin是物理化学家,但他们对科学的贡献最终主要体现在分析化学领域,这是典型的学科交叉。今天,很多物理学家、纳米化学家、有机和无机化学家与分析化学家合作发展了很多用于色谱分析的新理论新材料新方法。在生命化学领域,化学与生物学的交叉、与临床医学的交叉更是催生了各种生命分析化学方法的出现,包括用于基因组学、蛋白质组学、代谢组学等前沿领域的色谱新方法。至于色谱仪器的创新则更是多学科研究人员共同参与的结果。第四,不懈坚持和勇于探索是技术创新的必要条件。对于科学工作者来说,这应该是不言而喻的。历史上重要的科学突破无不是科学家长期坚持的结果,色谱亦然。任何急功近利的浮躁做法都是和科学精神背道而驰的,因此科学研究的评价机制也必须符合科学发展的规律。

尽管色谱经历了100多年的发展,尽管已经有各种很成熟的色谱方法,但我们相信,色谱技术在未来还会有重要的发展,这可能主要体现在:(1)分离材料的创新将使分析速度更快,分离效率更高;(2)新的检测技术的出现将使分析灵敏度更高,从而使单分子分析真正成为可能;(3)色谱仪器与其他仪器(包括样品处理、检测和数据处理技术)的联用将使色谱分析的自动化程度更高,应用也将更为广泛。(4)在应用方面,生命组学研究无疑是色谱发挥更大作用的领域;新药的研发、重大疾病的诊断与治疗、环境污染分析和治理都离不开色谱分离分析。总之,随着现代科学技术的高速发展,各种色谱技术也将持续发展,这必将为社会为人类做出更大的贡献。

致谢: 本文是在为色谱技术丛书第三版的《色谱分析概论》撰写的第一章部分内容的基础上扩充而成的。丛书第三版的出版得到了化工出版社和安捷伦科技公司的大力支持,特此致谢!