用于富集磷酸化合物的温度敏感亲和色谱材料的制备及其应用

戴国鑫, 王 迪, 王 彦, 曹之涵, 戴荣继

(北京理工大学生命学院, 北京 100081)

蛋白质的可逆磷酸化,是一种极为重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式[1-5]。蛋白质的可逆磷酸化是受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶共同作用的结果。这一过程参与调控了包括细胞信号转导、酶活性调节、分子间相互识别和作用、细胞分裂和凋亡等几乎所有重要的生命过程[6-9]。

异常的磷酸化过程会直接影响蛋白质的诸多特性,包括蛋白质间的作用机制、空间结构和亚细胞定位等,进而导致一些恶性疾病的发生,包括阿尔茨海默氏病、心血管疾病、糖尿病和癌症等[10-14]。因此,对磷酸化蛋白质进行高效的分离鉴定,有助于全面深入地研究与思考,有利于更深层次地理解复杂的生命活动,阐明生理病理变化机理。

磷酸化蛋白质的丰度往往很低,离子化程度小,其质谱信号经常被一些高丰度蛋白质和大量非磷酸化蛋白质掩盖,导致无法分析鉴定。因此需要将低丰度的磷酸化蛋白质富集后分析。目前,常用来富集和分离磷酸化蛋白质的方法有免疫亲和沉淀法、色谱法和化学修饰磷酸基团法。其中方法最成熟、应用最广泛的是固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法[15-18]。但这两种方法往往需要以切换流动相的方式达到富集目的,而且流动相通常为浓度较高的盐溶液或是有机溶剂占比较高的混合液,这些条件均会对磷酸化蛋白质的结构和功能造成影响。

温度敏感聚合物(temperature-responsive polymers)是一种智能高聚物。聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)因具有极窄的相变温度区间(1～2 ℃)和接近人类体温的最低临界溶解温度(LCST, 31 ℃),而被深入研究并广泛应用[19,20]。

本文基于表面引发的可逆加成断裂链转移聚合(SI-RAFT)法,通过快速引入官能团法制备了二氧化硅@聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-氨甲基膦酸)-钛离子(Ⅳ)(silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+)温度敏感色谱固定相,通过对4种类固醇的分离,表征了其温度敏感性能。对该材料的接枝构象和使用时流动相的pH值进行了优化。最后,在温和pH条件下测试了其对三磷酸腺苷(ATP)的捕获和释放性能。实现了silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+对ATP的富集和快速分离,为在温和条件下对磷酸化蛋白质的富集奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); VERTEX 70v FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司); Quanta 200F场发射环境扫描电镜(美国FEI公司); PHI Quantera II扫描微区X射线光电子能谱仪(XPS,日本Ulvac-PHI公司); DISCOVERY热失重分析仪(TGA)、Q2000差示扫描量热仪(美国TA公司); FA2004电子天平(上海越平科学仪器有限公司); STARTER 3100 pH计(上海奥豪斯仪器有限公司)。

NIPAAm为分析纯,购自东京化成工业株式会社;ATP纯度≥98%, 4-二甲氨基吡啶(DMPA)、乙酰甘氨酸、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)纯度均≥99%,N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)纯度为98%,偶氮二异丁腈(AIBN)、氨甲基磷酸(AMPA)均为分析纯,以上均购自北京百灵威科技有限公司;氨基化硅胶(silica@NH2)粒径为5 μm,孔径为3×10-8m,购自天津博纳艾杰尔科技有限公司;二硫化碳、三辛基甲基氯化铵、正十二硫醇纯度均≥98%,三氯甲烷为分析纯,以上均购自国药集团化学试剂有限公司;氢化可的松、地塞米松、丁酸氢化可的松、醋酸泼尼松龙纯度均≥99%,均购自中国药品生物制品检定所。其他试剂如乙醇、甲醇、1,4-二氧六环、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃和二甲基甲酰胺等均购自北京化学试剂公司,使用之前均用氢化钙、无水硫酸镁等试剂除水、蒸馏，待用。

1.2 色谱材料的制备

1.2.1链转移剂(CTA)的制备

S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯的制备主要参照文献提供的方法[21]。在250 mL三口圆底烧瓶中加入12 mL正十二硫醇、0.80 g三辛基甲基氯化铵和60 mL丙酮。在冰浴和氮气保护条件下,滴加3 mL质量分数为50%的氢氧化钠溶液,搅拌20 min,然后将3 mL二硫化碳和6.5 mL丙酮一同注入三口烧瓶中,加入6 mL氯仿并继续搅拌20 min。最后将13 mL质量分数为50%的氢氧化钠溶液在30 min内滴入,于室温反应12 h,加入100 mL水,在冰浴条件下用浓盐酸酸化至pH值为3,抽滤,用100 mL异丙醇溶解固体,再次抽滤,收集滤液,浓缩,用正己烷重结晶,真空干燥,得到的金黄色晶体,即为S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯,作为CTA。

1.2.2CTA修饰硅胶(silica@CTA)的制备

30%接枝密度的silica@CTA:将1.0 g silica@NH2、0.6 g DMPA、60 mL二氯甲烷、0.486 g CTA和0.071 g乙酰甘氨酸加入三口瓶中,在氮气保护、冰浴条件下,将6 mL DIC在30 min内滴入,于室温反应48 h。产品分别用二氯甲烷洗涤2次,用乙醇洗涤2次,用甲醇洗涤1次,并于45 ℃烘干。

50%接枝密度的silica@CTA:使用0.809 g CTA试剂和0.047 g乙酰甘氨酸,其余操作同制备30%接枝密度silica@CTA操作。

1.2.3silica@p(NIPAAm-co-NAS)的制备

将0.3 g 30%或50%接枝密度的silica@CTA、3.5 g NIPAAm、0.69 g NAS和15 mL 1,4-二氧六环加入到三口烧瓶中,在氮气保护条件下,加入30 mg AIBN,于60 ℃反应12 h。产品用乙醇洗涤2次,用水洗涤2次,用甲醇洗涤1次,于50 ℃烘干。

1.2.4silica@p(NIPAAm-co-AMPA)的制备

将0.2 g AMPA溶于5 mL甲醇中,作为溶液A;将0.3 g silica@p(NIPAAm-co-NAS)溶于10 mL甲醇中,作为溶液B。在冰水浴条件下,将溶液A滴入溶液B中,反应48 h,每隔2 h超声5 min,最后用甲醇和水各洗涤3次,真空干燥。

1.2.5silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的制备

取0.25 g silica@p(NIPAAm-co-AMPA),溶于100 mmol/L Ti(SO4)2溶液中,搅拌8 h。搅拌完成后将产品离心分离并水洗3次,真空干燥后即得silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,其合成流程图见图1。

图 1 SI-RAFT法制备silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的流程图Fig. 1 Flowchart of preparation of silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+ by surface initiated-reversible addition fragmentation chain transfer (SI-RAFT) methodNIPAAm: N-isopropylacrylamide; NAS: N-acryloxysuccinimide; AIBN: azodiisobutyronitrile.

1.2.6热失重分析

TGA法测定各种材料的失重率,计算silica@p(NIPAAm-co-AMPA)的接枝率。测试条件:N2保护,升温速率为10 ℃/min,升温范围为30～800 ℃。

1.2.7差示扫描量热(DSC)分析

DSC法用于表征温度敏感聚合物的LCST。将silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在pH=7的10 mmol/L磷酸盐缓冲液中溶胀达平衡,弃去水层得到水和硅胶。测试条件:N2保护,升温范围为10～60 ℃,升温速率为1 ℃/min。

1.2.8性能测试

使用实验室自制的装柱系统,将silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+溶解于甲醇中,装入不锈钢柱(50 mm×2.1 mm)中。成品柱连接到高效液相色谱仪上,用甲醇和水清洗待用。以4种类固醇为分析对象,测试silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的温度敏感性能,优化其接枝构象和使用该固定相时流动相的pH值。以单磷酸腺苷(AMP)和NAS,以及ATP为分析对象测试该材料对含磷酸基团的小分子化合物的捕获和释放性能。

2 结果与讨论

2.1 CTA的表征

对于RAFT法,CTA的使用是最重要的一环,它直接决定反应的成败。本文选用活性较高的S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯作为CTA。合成CTA的反应需要在强碱条件下进行,并使用三辛基甲基氯化铵作为相转移催化剂来实现合成。

通过分析CTA的傅里叶变换红外光谱图(见附图1,http://www.chrom-China.com,下同),可以看出,1716 cm-1处归属于羧基中C=O的伸缩振动峰；1280 cm-1处为硫酯基中C-S的伸缩振动峰；1070 cm-1为硫酯基中C=S的伸缩振动峰，而且在2918 cm-1处有明显的C-H的弯曲振动峰，说明产物分子中含有羧基、硫酯基和亚甲基。通过分析核磁共振谱图(见附图2),进一步证明合成的产物为S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯。

2.2 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+制备过程的分析

先在silica@NH2表面修饰CTA,即制备silica@CTA。通过调整CTA和乙酰甘氨酸的比例控制硅胶表面CTA的密度,再用AIBN在硅胶表面引发NIPAAm和NAS的共聚,生成silica@p(NIPAAm-co-NAS)。然后利用氨甲基磷酸(AMPA)和NAS发生活性酯氨基置换反应,从而将磷酸基团引入到高分子链上,即生成silica@p(NIPAAm-co-AMPA)。AMPA是钛离子的螯合剂,由于其含有磷酸基团而有利于提高材料的选择性。最后,以Ti(SO4)2为钛源,将钛离子修饰在温度敏感高分子链上,形成silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+。需要注意的是,在发生置换反应时可能含有少量的NAS未参与反应,一般在材料制备好之后通过异丙胺来置换未反应的NAS。

表 1 silica@NH2、silica@CTA、silica@p(NIPAAm-co-NAS)、silica@p(NIPAAm-co-AMPA)和 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的组成元素含量Table 1 Constituent element contents of silica@NH2, silica@CTA, silica@p(NIPAAm-co-NAS), silica@p(NIPAAm-co-AMPA) and silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+ %

CTA: chain transfer agent; AMPA: (aminomethyl) phosphonic acid.

2.3 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的表征

分别对silica@NH2、silica@CTA、silica@p(NIPAAm-co-NAS)和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)进行红外光谱表征,鉴定合成材料中特殊官能团的种类,结果见附图3。对于silica@CTA(见附图3b), 1 650 cm-1处为酰胺键中C=O的伸缩振动峰,1 510 cm-1和1 470 cm-1为酰胺键中N-H的弯曲振动峰,表明CTA被成功地接枝在硅胶上。对于silica@p(NIPAAm-co-NAS)(见附图3c), 1 650 cm-1和1 550 cm-1为PNIPAAm的特征峰(酰胺Ⅰ和Ⅱ带), 1 790 cm-1和1 740 cm-1为NAS中C=O的对称和不对称伸缩振动峰,1 815 cm-1为NAS中琥珀酰亚胺中C=O的伸缩振动峰,表明NIPAAm和NAS成功聚合。对于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)(见附图3d), NAS的3个特征峰较弱,在1 440 cm-1出现P-O的伸缩振动峰,说明AMPA已成功置换。

红外光谱为定性测量方法,不能完全准确地证明材料接枝情况。因此还需采用XPS来定量分析元素的组成。如表1所示,C 1代表碳元素,O 1s代表氧元素,N 1s代表氮元素,S 2p代表硫元素,P 2p代表磷元素,Ti 2p代表钛元素。silica@NH2与silica@CTA相比,S元素从无到有,说明S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯已成功接枝到硅胶表面;silica@p(NIPAAm-co-NAS)与silica@CTA相比,S元素的减少和O元素的增加,表明NIPAAm和NAS成功接枝到硅胶表面,佐证了红外谱图的结果;silica@p(NIPAAm-co-AMPA)与silica@p(NIPAAm-co-NAS)相比,其P元素的增加表明AMPA已成功置换。对于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,从表中可以看出,最终有0.54%的钛离子被成功固定在色谱材料上。对比FT-IR和XPS的结果,表明silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+被成功合成。

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对于温度敏感的色谱材料来说,接枝率是关乎其最终温敏性能的重要参数,而接枝率可以通过热失重分析计算得到。附图4为3种修饰硅胶的TGA图。可以看出，silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在100 ℃之前热失重较小,主要是吸附在材料上的水分蒸发所致;250～450 ℃之间热失重率变化最明显,主要是接枝在硅胶表面上的聚合物和修饰基团的受热分解所致;当温度升到700 ℃时,材料中的所有聚合物与修饰基团完全被碳化,所以失重率已基本不变。silica@NH2、silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在100～700 ℃之间的失重率分别为5.20%、7.51%和23.18%,因此silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的接枝率为15.67%。

采用差示扫描量热法表征silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的温度敏感性能。附图5为silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的DSC图。结果表明,silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在36.5～45.6 ℃间有一个明显的倒峰,其最低临界温度(LCST)为38.5 ℃。该材料相变温度范围在10 ℃之内,并具有温度敏感性能。

2.4 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的应用研究

2.4.1温度敏感性能测试

对于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,为进一步考察其温度敏感性能。选用4种类固醇(氢化可的松、地塞米松、丁酸氢化可的松和醋酸泼尼松龙)作为标准分析物。观察4种类固醇在制备的色谱柱中的保留行为,以判断材料对温度的响应的能力。如图2所示,随着温度的升高,类固醇色谱峰的个数从1个变成4个,表明改变温度能有效分离4种类固醇。

图 2 4种类固醇在不同色谱柱温度下的色谱图Fig. 2 Chromatograms of the four kinds of steroids at the different column temperature Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: ultrapure water; flow rate: 0.15 mL/min; detection wavelength: 254 nm; injection volume: 3 μL. Peak identifications: 1. hydrocortisone; 2. dexamethasone; 3. hydrocortisone butyrate; 4. prednisolone acetate.

2.4.2接枝构象的优化及测试

类固醇的分离结果表明所制备的材料具有良好的温度敏感性能,符合温度敏感材料的基本要求。silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+中引入了Ti4+离子,会影响水分子与温敏材料间氢键的形成,从而对材料的温敏性能产生影响。为了使材料的温度敏感性能达到最佳,需要对silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的接枝率和接枝密度进行优化。为此分别制备了接枝密度为30%和50%,以及接枝率在10%～15%、15%～20%、20%～25%和25%～30%之间共8种色谱材料,并探究其对类固醇的分离效果(见附图6)。结果表明,接枝密度为50%的修饰硅胶对醋酸泼尼松龙的分离效果要优于接枝密度为30%的硅胶,而在两种密度的硅胶中,当接枝率在20%～25%时,分离效果达到最佳。所以该材料的最佳接枝率为20%～25%,最佳接枝密度为50%。

图 3 不同柱温下AMP和NAS的色谱图Fig. 3 Chromatograms of adenosine monophosphate (AMP) and NAS at the different column temperatures Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: 48.5%(v/v)water-50%(v/v) acetonitrile (ACN)-1.5%(v/v) trifluoroacetic acid (TFA); detection wavelength: 260 nm; injection volume: 3 μL.

随后用具有最佳构象的材料对含磷酸基团的化合物进行分离,以AMP和NAS为分析对象。如图3所示,当柱温为50 ℃时,两种物质并没有被完全分离;当柱温为10 ℃时,两种物质被完全分开。这是因为当温度高于LCST时,接枝在硅胶表面的温度敏感高分子长链处于蜷缩状态,修饰在长链上的钛离子被遮掩,不能与磷酸基团充分接触,所以并没有起到分离AMP的作用;而当温度低于LCST时,此时温敏长链处于伸展的状态,Ti4+充分暴露在流动相中并与AMP发生相互作用,从而实现对AMP的保留。随着温度上升,两个物质的色谱峰峰宽变大,这是分析物在聚合物链中扩散的结果,属于正常现象。由此,达成了仅通过改变温度就能实现对含有磷酸基团的化合物的分离。

2.4.3流动相pH值的优化及测试

图 4 不同流动相pH值条件下PLP的色谱图Fig. 4 Chromatograms of pyridoxal phosphate (PLP) under the different pH values of the mobile phases Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection amount: 8 μL.

选取pH值分别为1、3、5和7的磷酸盐缓冲液流动相测试材料对磷酸吡哆醛(PLP)的捕获能力。如图4所示,当pH值从7降至3时,PLP的保留时间逐渐增加,峰面积逐渐减少。这一现象符合固定钛离子亲和色谱的一般规律,当pH值降低时,Ti4+的酸性增强。由于电荷间相互作用,Ti4+与磷酸基团的结合能力增强,使PLP保留时间增加。当pH降为3时,PLP的色谱峰几乎消失,这说明固定相与PLP的结合能力达到最大,PLP几乎完全被色谱柱捕获。而当pH值降为1时,PLP的保留时间突然减小,说明固定相对PLP几乎没有保留作用。这一现象和磷酸基团的酸度有关:当酸性较强时,磷酸基团质子化程度加强,其羟基以H+的形式存在而失去和Ti4+的结合能力;当碱性过强时,Ti4+会以Ti(OH)4形式存在。因此过酸过碱都不利于磷酸基团和钛离子结合。故silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+捕获磷酸化合物时的最优pH值为3。

图 5 在不同流动相pH值条件下PLP和NAS的色谱图Fig. 5 Chromatograms of PLP and NAS under the different pH values of mobile phases Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 280 nm; injection amount: 1 μL.

材料释放磷酸化合物时流动相的pH值也需要优化,以PLP与NAS的混合样品作为分析对象,考察流动相pH值对材料释放磷酸化合物的影响。如图5所示,NAS中不含磷酸基团,故不能被色谱柱捕获,均在进样后最先流出,故不参与讨论。当柱温保持恒定(50 ℃),在30 min处切换流动相pH值后,钛离子与磷酸基团之间的作用力消失,在40 min时PLP被完全释放出来,此时PLP的峰面积为完全释放时的最大值(见图5d)。当保持流动相pH值不变而改变柱温时,释放效果会因pH值的不同而不同。当pH=3时,升温后几乎没有色谱峰出现,这说明PLP并没有被释放出来(见图5a);而随着pH值的提高,PLP的峰面积逐渐增大,当pH值上升至7时,出现PLP的色谱峰(见图5c),表明PLP被有效释放,因此pH=7为材料释放磷酸化合物时的最佳pH值。而此时PLP的峰面积与图5d的峰面积几乎相同,说明该材料能通过改变温度高效地释放分析物,具有极佳的释放性能。综合以上结果,选用pH=7的流动相进行后续的检测与分析。

选取ATP作为分析物,测试silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+对小分子磷酸化合物的捕获和释放性能。如图6所示,曲线b和c分别表示在高温(50 ℃)和低温(10 ℃)的柱温下ATP的色谱图。可以看出,ATP的保留行为有明显的温度依赖性,柱温为50 ℃时,ATP在色谱柱上没有保留,很快被洗脱;而柱温为10 ℃时,60 min内ATP都没有被洗脱下来,证明被色谱柱完全捕获。从曲线a可以看出,当柱温在进样后20 min由10 ℃升温至50 ℃时,低温下捕获的ATP被快速地释放出来。以上结果表明silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+温度敏感色谱材料可以仅通过温度的改变来实现对磷酸化合物的捕获和释放。silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+具有优良的释放能力,被捕获的ATP可以在7 min内被释放完全且回收率为85.2%。

图 6 不同柱温条件下ATP的色谱图Fig. 6 Chromatograms of ATP at the different column temperatures Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: pH=7; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection volume: 3 μL.

2.4.4使用寿命研究

除了具有较好的释放性能,silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+还具备使用寿命长的特点。虽然在使用过程中钛离子会随着使用次数的增加而减少,但是因为钛离子的固定条件温和且固定成功率较高,因此可以通过在线补充的方式来恢复材料钛离子的含量。如图7所示,在使用两周后(大于15次),该材料对于ATP的释放性能降低,其释放峰几乎消失。而补充钛离子后,材料释放性能相应提高,其释放峰重新出现。

图 7 钛离子补充(a)前、(b)后ATP的色谱图Fig. 7 Chromatograms of ATP (a) before and (b) after supplementation of titanium ion Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: pH=7; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection volume: 1 μL.

3 结论

本文基于SI-RAFT法,通过快速引入功能基团成功制备了固定金属离子温度敏感亲和色谱材料silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+。该富集材料具备温度敏感性能，能实现在仅改变温度不切换流动相的条件下对磷酸化合物的在线选择性富集与分离。该材料的成功合成为富集分离磷酸化蛋白质奠定了基础。