鄱阳湖区某农田土壤中多环芳烃降解菌物种多样性调查

金卫根 王雅

摘要：从鄱阳湖区南昌县某湖畔稻田、湖畔莱地、岸堤莱地和堤内稻田分别采集土样，用浓度大于95%的PAHs试剂菲、蒽和苯并菲等为唯一碳源设置培养基，从土样中筛选PAHs降解菌。经培养和分离纯化，共筛选到菌株23种，其中细菌17种，真菌6种，对所筛选到的菌株进行形态观察和分析。

关键词：鄱阳湖区;农田土壤;多环芳烃降解菌;物种多样性

多环芳烃（PAHs）广泛存在于土壤环境中，在自然条件下难于降解，对人类健康和生态安全构成了极大危害[1-2]，近年来，对土壤PAHs的研究报道呈持续增长的态势[3]。鄱阳湖区是江西省农产品主产区，特别是自2009年底国务院正式批复《鄱阳湖生态经济区规划》以来，鄱阳湖区已经成为江西省生态文明先行示范区开发与建设的主战场。因而治理鄱阳湖区农田土壤中的PAHs污染，是迫在眉睫的任务。

笔者分别从鄱阳湖区南昌县某湖畔稻田、湖畔菜地、岸堤菜地和堤内稻田采集土样，用浓度大于95%的PAHs试剂菲、蒽和苯并菲作为唯一碳源设置培养基[4]，从土样中筛选出能够降解PAHs的降解菌，对降解菌的物种多样性進行形态观察和分析，为下一步开展鄱阳湖区农田土壤PAHs污染的微生物修复提供优良菌种。

1 试验材料与方法

1.1 土样

土壤样品分别采挖于鄱阳湖区南昌县4个不同的农田生境（见表1），通过棋盘式布点采样，采集表层土壤（0-20cm），新鲜土样装于保鲜袋中，置于4℃冰箱保存。

1.2 培养基

1.2.1 无机盐液体培养基：K₂HPO₄6g/L、KH₂PO₄2g/L、NH₄NO₃、1g/L、NaCI 3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、FeSO₄0.02g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0039/L、MnCI2·4H₂O 0.0039/L、CoCl₂·6H₂O 0.001g/L、CUSO₄·5H₂O 0.001g/L、H₂O1000mL、pH值7.0～7.2，用高压蒸气灭菌锅在121℃条件下灭菌25min后备用。

1.2.2 PAHs降解菌筛选液体培养基：在无菌操作条件下，分别在灭好菌的无机盐液体培养基中加入PAHs试剂菲、蕙或苯并菲。

1.2.3 PAHs选择性固体培养基：把琼脂加入到无机盐培养基中成为固体支持物，再放入高压灭菌锅内，在121℃条件下灭菌。之后进一步在该固体培养基上均匀涂布PAHs-丙酮溶液，至丙酮完全挥发后备用[5]。

1.3 PAHs试剂

试剂菲（Phenanthrene）的纯度为95%，试剂蒽（An-thracene）的纯度为97%、均购自上海晶纯试剂有限公司，苯并菲（Triphenylene）纯度为97%、购自Alfa Aesar，johnson matthey公司。

1.4 土壤PAHs降解菌的筛选

筛选前准备好试管、三角瓶、涂菌棒、吸管、培养皿、接种环等，并经严格消毒后备用。

制备土壤样品的稀释液，在无菌条件下操作。首先把含有PAHs试剂菲、蕙和苯并菲（浓度均为50mg/L）的无机盐培养基装入250mL的三角瓶中，再分别向三角瓶内加入1g土样（上述4个不同的农田生境土样分4批操作），灭菌玻璃珠25粒左右，在25℃时以120r/min水浴摇床避光培养5d，之后取上清液10mL，进一步转接到新配置的选择性无机盐培养基中，又经上述同样的条件，连续进行富集培养5次，直到培养基中出现明显的浑浊为止。然后吸取0.5mL的降解菌培养液，在稀释10倍后，再在含有PAHs试剂的选择性固体培养基上用平板划线法反复划线多次，经培养3-5d后可以分离纯化出同一形态的单一菌种[6]，用于进行菌体形态观察和分析。

2 土壤PAHs降解菌筛选结果

对本实验的筛选结果进行形态观察和分析，区分细菌和真菌，对细菌进行革兰氏染色。经统计，发现共筛选到菌株23种，其中细菌17种，真菌6种，每种菌株的形态特征见表2。

3 结果分析

（1）普遍认为，在农田土壤中存在一定种类和数量的 PAHs土著降解菌[7]。由于鄱阳湖区农田生境多样，不同的农田生境对PAHs降解菌的选择性不同，必能表现出PAHs降解菌的多样性，本结果也证明了这一点。

（2）在农田土壤中，不仅细菌多样性丰富，真菌也有很高的多样性，但本实验中筛选到的真菌种类较少，可能是由于真菌在分离培养时难以PAHs为唯一碳源生长的原因[8]。在实验中发现，同样的培养条件，细菌较之真菌，在培养初期生长、分裂的速度较慢。

（3）本实验成功筛选到PAHs降解菌23种，但由于菌源对多环芳烃降解菌的筛选有明显影响[9]，本实验所筛选的PAHs降解菌在多样性方面仍有一定的局限性，下一步将扩大采样范围，以期筛选到更多的PAHs降解菌，为进一步驯化高效降解菌提供菌种资源。

4 结语

由于PAHs广泛分布于土壤环境中，任何有机物的燃烧、加工使用，或废弃的地方都有可能产生PAHs。土壤中的PAHs，极少量可能来源于植物和土壤中的细菌合成，绝大部分则来源于人们日常的工农业生产和生活活动[10]。石化化工产业过程中的石油泄漏或炼油过程;工业生产中的燃煤;交通运输中的汽车尾气排放或轮胎摩擦;日常生活中燃烧煤炭、使用天然气、或者有机固体废物的倾倒等，都会产生大量的PAHs[11]。正因为如此，鄱阳湖区作为江西省生态文明建设先行示范区，其PAHs污染的修复显得十分迫切和繁重，而微生物修复作为生态效益最高的一种手段，应是下一步重点发展的方向，本实验将为鄱阳湖区农田土壤PAHs污染的微生物修复提供菌种资源和科学依据。

参考文献：

[1]陈春云，岳珂，陈振明，等.微生物降解多环芳烃的研究进展[J].微生物学杂志，2007，27（6）：100-103

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[3]吴健，王敏，靳志辉，等.土壤环境中多环芳烃研究的回顾与展望[J].土壤学报，2016，53（5）：1085-1096

[4]唐婷婷，金卫根.多環芳烃生物降解机理研究进展[J].土壤，2010，42（6）：876-881

[5]金卫根，陈传红，周亚平，等.两株多环芳烃降解菌对菲、蒽、笨并菲的降解效果[J].贵州农业科学，2013，41（3）：73-76

[6]金卫根，陈传红，周亚平，等.两株多环芳烃降解菌的筛选与生化鉴定[J].农业科技与信息，2015（17）：86-89

[7]刘魏魏，尹睿，林先贵，等.多环芳烃污染土壤的植物-微生物联合修复初探[J].土壤，2010，42（5）：800-806

[8]吴宇澄，林先贵.多环芳烃污染土壤真菌修复进展[J].土壤学报，2013，50（6）：1191-1199

[9]伍凤姬，张梦露，郭楚玲，等.菌源对多环芳烃降解菌的筛选及降解性能的影响[J].环境工程学报，2014，8（8）：3511-3518

[10]Kordybach BM，Smreczak B，Pawlas AK.Concentrations，sources，and spatial distribution of individual polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in agricultural soils in the Eastern part of the EU：Poland as a casestudy.Sci Total Environ，2009，407（12）：3746-3753.

[11]Manilal VB.，Alexander M.Factors affecting the microbial degrada-tion of phenanthrene in soil.Appl Microbiol and Biotechnol，1991，35（3）：401-405