高效液相色谱 串联质谱法同时测定农田土壤中31种三嗪类除草剂残留

王晓春+刘庆龙+杨永亮

摘 要 建立了高效液相色谱 三重四极杆串联质谱（HPLC MS/MS）同时检测农田土壤中31种三嗪类除草剂残留的分析方法。土壤样本经加速溶剂萃取，Oasis MCX固相萃取柱净化后，在多反应监测（MRM）正离子电喷雾模式下进行HPLC MS/MS分析。色谱柱为Phenomenex Luna C18反相柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm），流动相为梯度变化的乙腈和0.1%甲酸溶液。检出限（S/N≥3）为0.008～0.440 μg/L，在各自的考察浓度范围内线性关系良好（r≥0.996）；在0.40～40.0 μg/kg 添加水平内，平均加标回收率为76.9%～102.0%，RSD为3.4%～10.3%。利用本方法对沈阳地区农田表土的筛查发现，阿特拉津、西玛津、扑草净和脱乙基阿特拉津为该区域主要的三嗪类除草剂物种。

关键词 高效液相色谱 串联质谱；农田土壤；三嗪类除草剂

1 引 言

三嗪类除草剂是结构上以具有3个碳和3个氮对称排列的六元环结构为母体的一类化合物，因此又被称作均三氮苯类除草剂。自20世纪50年代被推出以来，其作为预防农田杂草生长的高效除草剂在世界范围内广泛使用，并在农业上发挥了重要的作用。尽管近年来有新型除草剂逐渐取代三嗪类除草剂的趋势，但三嗪类除草剂仍是我国所采用的大型品种系列，每年产量、用量均很大。该类除草剂具有一定的“三致”作用， Sanderson等[1]发现，阿特拉津等三嗪类除草剂能通过改变人体内CYP19酶的活性而干扰和破坏生物体的内分泌系统平衡， 引起包括癌症在内的一系列病症。美国环保署将阿特拉津、西玛津等列入优先控制污染物名单，欧盟在2007年底全部停止了三嗪类除草剂在农业中的使用。

三嗪类除草剂分子因其低水溶性，可形成独立的非水相而极易吸附到土壤固相中， 加上特有的均三氮苯环结构能抵抗微生物的进攻， 因此不易被微生物所降解，虽然土壤自身的净化作用可以减少三嗪类除草剂的污染程度，但如果进入土壤中的三嗪类除草剂含量在数量和速度上超过土壤的环境容量， 仍会导致土壤的污染，并随着降水、淋溶和径流的作用，引起地表水和地下水污染。因此，建立农田土壤中三嗪类除草剂的快速、高效、准确的检测方法是确保我国的农田生态环境安全的前提和迫切任务之一。

目前，对三嗪类除草剂残留检测方法的研究主要集中在水体[2～5]、谷物[6～9]、水果[10]、体液[11]、底泥[12]和动物内脏[13]等生态环境样品，采用的方法包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱 质谱联用法（GC MS）、液相色谱 质谱联用法（HPLC MS）和液相色谱 串联质谱法（HPLC MS/MS）等，但涉及土壤中三嗪类除草剂的检测多见于单残留检测或少量三嗪类除草剂品种的检测[14～18]，而对土壤的多残留检测报道相对较少。本实验建立了检测农田土壤中31种三嗪类除草剂残留量的HPLC MS/MS方法。本方法简单可靠， 灵敏度高， 能满足土壤中三嗪类除草剂环境残留监控的需要。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

API4000高效液相色谱 三重四极杆串联质谱，配有电喷雾离子源和Analyst 1.4.2 工作站（美国AB SCIEX公司）； DIONEX 200型加速溶剂萃取仪；KL512/519J型氮吹仪（北京康林科技有限公司）；METLER TOLEDO AL204型电子天平（瑞士METLER公司）。 免疫亲和柱（Oasis MCX固相萃取柱，3 mL/60 mg， Waters公司）。

甲醇和乙腈（Fisher Scientific公司）；甲酸（色谱纯，百灵威公司）；实验用水为Millipore高纯水。

31种标准样品（阿特拉津、西玛津、另丁津、脱乙基另丁津、特丁津、环丙津、扑灭津、草达津、莠灭净、敌草净、嗪草酮、西草净、盖草津、异戊乙净、扑草净、特丁净、杀草净、叠氮津、西玛通、莠去通、扑灭通、密草通、特丁通、苯嗪草酮、环嗪酮、草净津、脱乙基阿特拉津、脱异丙基阿特拉津、脱乙基脱异丙基阿特拉津、吡唑草胺、异丙甲草胺）纯度大于97%，购于Sigma Aldrich公司。

2.2 混合标准溶液的配制

分别称取31种三嗪类除草剂标准品2.0 mg，置于棕色样品瓶中，溶解于10 mL甲醇中，得到浓度为200 mg/L的单标储备液。精密量取各单标储备液40 μL，添加360 μL甲醇，配成为浓度为5 mg/L的混标溶液储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

标准曲线溶液的配制：取5 mg/L混标溶液储备液适量，以甲醇进行逐级稀释，得到浓度分别为0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0， 100.0和200.0 μg/L的梯度混合标准溶液。

2.3 样品前处理

2.3.1 样品的提取 土壤样本放置于阴凉处自然晾干，粉碎后过40目筛。称取10 g样品，放入加速溶剂萃取仪22 mL固相萃取池中，以丙酮 二氯甲烷（1∶1，V/V）为萃取溶剂进行加速溶剂萃取。设定萃取温度60 ℃，预热时间5 min，静态时间10 min，，萃取压力为10.3 MPa，循环次数2次。吹扫时间90 s。提取液氮吹近干后，用1 mL 5%甲酸的二氯甲烷溶液复溶，待净化。

2.3.2 样品的净化 依次用4 mL丙酮和2 mL二氯甲烷预淋洗Oasis MCX固相萃取小柱后，提取液上柱，再用1 mL5%甲酸的二氯甲烷溶液洗涤样品瓶一次，洗液过固相萃取柱，弃去流出液；用2 mL二氯甲烷淋洗固相萃取柱，用吸耳球吹出柱内残留的液体。最后用4 mL 5%氨水乙腈溶液淋洗，用吸耳球吹出柱内残留液体，收集洗脱液并浓缩近干，用乙腈∶水（2∶3，V/V）溶液溶解残渣并定容至2 mL，膜过滤，待测。

2.4 色谱与质谱条件

2.4.1 液相色谱条件 色谱柱： Luna C18 柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm，美国Phenomenex 公司）；柱温： 30 ℃；进样量5 μL。 以0.1%甲酸溶液（A相）和乙腈（B相）流动相进行线性梯度洗脱，具体梯度洗脱条件见表1。

2.4.2 质谱条件 离子源： 电喷雾离子源（ESI）， 扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM） 模式；离子喷射电压（IS）：5200 V；雾化温度（TEM）：550 ℃；源内气体1压力（GS1）： 0.448 MPa； 气体2压力（GS2）： 0.345 MPa； 气帘气体压力（Curtain Gas）： 0.103 MPa； 碰撞气压力（CAD）： 0.055 MPa； 其它质谱参数见表2。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理条件的优化

根据文献调研结果，土壤样品可以采用索式提取、超声萃取和加速溶剂萃取等方式进行提取，其中加速溶剂萃取技术由于操作简便、绿色环保及有利于批量处理而得到广泛应用。因此，本实验采用加速溶剂萃取技术对土壤中三嗪类除草剂进行提取。考察了提取溶剂、温度、压力等因素对提取效果的影响，发现当萃取温度在60 ℃，萃取溶剂为丙酮 二氯甲烷（1∶1，V/V），萃取压力为10.3 MPa，循环2次时提取效率最高。净化程序上，分别考察了3种固相萃取柱Oasis MCX、Oasis HLB和Supelclean LC SCX的净化效果，发现采用Oasis MCX固相萃取柱净化时，基线平稳且杂质少，效果较好。因此本实验采用Oasis MCX固相萃取柱对样品进行净化处理。

3.2 液相色谱和质谱方法优化

分别考察了Luna C18 柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm，美国Phenomenex公司）、Capcell Pak MG C18柱（100 mm × 2.0 mm × 3 μm，日本资生堂公司）和Symmetry C18（250 mm × 4.6 mm × 5 μm，美国Waters公司）对三嗪类除草剂的分析性能。研究表明，Symmetry C18柱待测物保留时间过长，不适合大批量样品的快速测试，而Capcell Pak MG C18柱虽然可以在较短时间内全部出峰完毕，但分离效果一般，且峰形不佳。在Luna C18 柱上，所有分析物在15 min前出峰，分离效果较其它两根色谱柱要好，且在24 min时能实现柱子的再平衡，因此选择Luna C18柱进行分析。为了达到最佳的色谱分离和良好的色谱峰形，考察了以甲醇 水、乙腈 水、乙腈 水（0.1%甲酸）和乙腈 水（0.05%甲酸）为流动相时的分离情况。发现以乙腈 水为流动相优于甲醇 水的分离效果流动相，且当在水中加入0.1%甲酸时能改善大部分三嗪类除草剂的峰形，说明甲酸更有利于化合物的离子化，

3.3 线性关系与检出限

在确定的最佳分析条件下，将不同浓度的混合标准溶液进行LC MS/MS分析，以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，不加权最小二乘法进行回归运算，求得31中三嗪类除草剂的线性回归方程。结果表明：31种三嗪类除草剂在各自的浓度范围内线性关系良好（r>0.996），可以满足定量分析的要求。以S/N≥3确定方法的检出限为0.008～0.440 μg/L。31种三嗪类除草剂的线性关系、线性范围和检出限见表3。

3.4 回收率和精密度

取空白土壤样品，分别制得浓度为0.4， 4.0和40.0 μg/kg添加水平的加标样品，按照2.3节方法进行样品提取和净化处理，外标法定量计算，每个浓度水平重复测定6次，得到添加浓度水平为0.4～40.0 μg/kg时，各化合物的平均回收率在76.9%～102.0%之间，RSD为3.4%～10.3%，方法显示了较好的回收率与精密度，满足农田土壤中三嗪类除草剂残留检测的要求，结果见表4。

3.5 样品分析

利用所建立的HPLC MS/MS分析方法对沈阳周边采集的36个农田土壤样本进行了检测。

4 结 论

建立了一种能对农田土壤中31种三嗪类除草剂同时快速分析的高效液相色谱 三重四极杆串联质谱分析方法。该方法能有效地消除土壤样本中复杂基质的干扰，保证了分析检测的准确性；方法的灵敏度高，可以满足实际样品测试的需要。利用该方法对东北地区农田土壤检测结果表明：农田中存在的主要三嗪类除草剂物种为阿特拉津、西玛津、扑草净和脱乙基阿特拉津。

References

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