云南榧树内生真菌TNF53的分子鉴定及抑菌活性研究

隋国强 马长乐 张金丽 李博文 李靖

摘要：为探明菌株TNF53的分类地位及其抑菌活性，采用试剂盒法、滤纸片扩散法和对峙培养法对从云南榧树叶片上分离得到的内生真菌TNF53 进行分子鉴定及其抑菌活性研究。初步鉴定，TNF53为炭疽菌（Colletotrichum），该菌粗提物对三七丝核病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀病菌、水稻稻瘟病菌和白菜黑斑病菌均表现出抑菌活性，其中对三七丝核病菌的抑菌活性最明显。以上结果表明该菌对植物病原真菌具有广谱抗性。

关键词：内生真菌;分子鉴定;云南榧树;抑菌活性

中图分类号：S476.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）01-0134-04

Molecular Identification and Antibacterial

Activity of Endophytic Fungus TNF53 Isolated from Torreya yunnanensis

Sui Guoqiang Ma Changle 2， Zhang Jinli 2， Li Bowen1， Li Jing 1

（1. Department of Life Sciences， Southwest Forestry University， Kunming650224， China;

2. College of Landscape Architecture， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract To identify the taxonomic status and antibacterial activity of TNF53 strain， the molecular identification and antibacterial activity of endophytic fungus TNF53 isolated from leaves of Yunnan eucalyptus were studied by kit method， filter paper diffusion method and sputum culture method. The TNF53 was initially identified as Colletotrichum. The crude extract of the strain showed antibacterial activity against Verticillium cinnabarium， Colletotrichum capsici， Fusarium solani， Magnaporthe grisea and Alternaria brassicae，especially against Verticillium cinnabarium. The above results indicated that the strain had broad-spectrum resistance to phytopathogenic fungi.

Keywords Endophytic fungus; Molecular identification; Torreya yunnanensis; Antibacterial activity

植物内生菌是指在一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中[1-3]、不造成植物病害的真菌或细菌，其种类丰富多样，且能与其宿主协同进化[4-6]。近年来，随着植物内生菌新的代谢产物不断被发现，以及越来越显著的应用价值，从植物中分離内生菌用以防治植物病虫害、人类疾病等已成为科技发展的一种趋势[7，8]，目前研究的一大热点就是从具有药用价值的植物中分离内生菌[9，10]。植物内生菌可通过多种途径发挥作用，有些能参与植物活性物质的合成，有些能够产生与宿主植物次生代谢产物相似或相同的物质[11-13]。Stierle等[14]1993年从短叶红豆杉（Taxus breviflia）中首次分离得到能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌;Stone[15]研究团队在2000年从澳大利亚北部当地居民常用于治疗外伤的药用植物蛇藤（Kenndia nigriscans）中分离得到1株新的内生链霉菌，其能产生新的多肽类抗生素munumbicins A、B、C 和D，该发现掀起了从药用植物中分离内生菌的热潮。目前，一些学者从榧树中分离出多种能产生紫杉醇及其衍生物的内生菌，但对这些内生菌的生物活性及其用做生物药物方面的研究较少[16-18]。

我国是一个农业大国，农作物和林木的病害常大规模发生，有些患病作物可引起人畜中毒，使国家经济和人民生活遭受严重损失，而一些优质高产品种往往因病害严重而被淘汰。目前主要防治手段仍是使用化学农药，由于农药的过多使用，导致3R（residue， resistence， resurgence）问题日益严重[19]。

因此，寻找具有抗菌活性的微生物资源，并将其用于防治植物病害及人类疾病具有非常重要的理论意义和实践价值[20，21]。为此，本试验对从云南榧树叶片上分离得到的内生真菌TNF53 进行分子鉴定及其抑菌活性研究，为该菌的进一步利用及其活性成分的分离鉴定奠定基础，为以后农林病害防治以及药物的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：内生真菌TNF53，由西南林业大学生命科学学院生物化学教研室提供。

供试病原菌：辣椒炭疽病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、小麦雪腐病菌（Typhula incarnate）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Cucumebrium）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、辣椒镰刀病（Fusariuum solani）、三七丝核病菌（Verticillium cinnabarium）、梨黑星病菌（Venturia pyrina）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Vasinfectum），均由西南林业大学生命科学学院生物化学教研室提供。

培养基： PD培养基、PDA培养基。

1.2 内生真菌TNF53的分子鉴定

1.2.1 DNA提取 采用UNIQ-10柱式真菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA。

1.2.2 PCR扩增 采用核基因组ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系：2×power Taq PCR Master Mix 12.5 μL， DNA 1 μL，ITS1 0.75 μL，ITS4 0.75 μL，ddH2O 10 μL。扩增程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环;72℃ 10 min。

将扩增产物交上海生物技术服务有限公司进行测序。登录NCBI，利用BLAST软件将测序结果与GenBank中已知序列进行比对，确定菌株所属类群。

1.3 TNF53粗提物对9种病原菌的抑菌活性测定

采用滤纸片扩散法[22]测定粗提物的抑菌活性。将倒置培养30 d的TNF53菌株连同培养基用消毒刀片划成3 cm×3 cm大小的菌块放置于250 mL锥形瓶内，向锥形瓶内倒入萃取液（乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸=80%∶15%∶5%），提取9 d，每3 d换一次萃取液，将得到的萃取液用旋转蒸发仪蒸干，溶于4 mL甲醇，所得溶液即为内生真菌TNF53菌株的次级代谢产物粗提物，于5 mL冻存管4℃冷藏柜中保存备用。将20 μL粗提物缓慢滴加在直径0.6 cm的灭菌滤纸片上，待其风干后分别放置在含有9种不同病原菌孢子的PDA培养基中，滴加甲醇溶液的干燥滤纸片作为对照（CK），每组3个重复，将所有培养皿于25℃培养室倒置培养5 d。采用十字交叉法测定抑菌圈直径并观察抑菌圈透明度，对有抑菌效果的菌株在其抑菌圈最透亮时拍照，整理数据并进行分析。

1.4 内生真菌TNF53与9种常见植物病原菌的对峙试验

将内生真菌TNF53和9种常见植物病原菌分别接种于PDA培养基中，于室温条件下扩大培养一周。采用对峙培养法[23]，在培养基同一半径周围用打孔器取直径为6 mm的菌丝块，同时接种于无菌PDA平板中，两接种点相距40 mm左右，室温培养。每组3次重复，记录观察内生真菌TNF53与病原菌之间是否有拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 内生真菌TNF53的分子鉴定

采用试剂盒提取内生真菌TNF53的DNA（图1A），经过PCR扩增，扩增产物大小在600 bp左右（图1B）。将测序结果在GenBank中进行比对，得出内生真菌TNF53属于炭疽菌属（Colletotrichum）。

2.2 内生真菌TNF53粗提物对9种常见植物病原菌的抑菌效果

由表1可知，内生真菌TNF53的粗提物对三七丝核病菌、辣椒炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、白菜黑斑病菌和辣椒镰刀病菌5种植物病原菌有一定的抑制效果。其中对三七丝核病菌的抑制效果最明显（图2A），对辣椒镰刀病菌（图2B）和水稻稻瘟病抑制效果较弱，而对黄瓜枯萎病菌、小麦雪腐病菌、梨黑星病菌和棉花枯萎病菌未表现出明显的抑菌活性。

2.3 植物内生真菌TNF53与9种常见植物病原菌的对峙结果

从试验结果可以看出，内生真菌TNF53对白菜黑斑病菌、三七丝核病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒镰刀病菌和辣椒炭疽病菌有一定的拮抗作用（图3）。与其他病原菌之间的拮抗效果不明显。

3 讨论与结论

经分子鉴定得出TNF53属于炭疽菌属（Colletotrichum）真菌。内生真菌TNF53的粗提物对水稻稻瘟病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀病菌、三七丝核病菌和白菜黑斑病菌有一定的抑制作用。其中对三七丝核病菌的抑制作用最明显，对辣椒镰刀病菌和水稻稻瘟病菌的抑制作用较弱;对黄瓜枯萎病菌、小麦雪腐病菌、梨黑星病菌和棉花枯萎病菌未表现出明显的抑菌作用。

内生真菌TNF53的粗提物对9株供试病原真菌表现出不同程度的活性，说明该菌的抑菌种类有一定的范围，证明了该内生真菌具有潜在的开发应用价值，显现出其作为生防菌的显著优势和良好的应用前景。但究竟是哪种物质起作用，还需要进一步研究。哈茨木霉菌的抑菌活性主要是几丁质酶发挥作用，通过克隆几丁质酶基因，可以得到大量的抑菌物质[24]。对真菌TNF53的研究才刚刚开始，因此，对该菌的抗菌活性产物分离及结构鉴定有待深入研究，进而为构建高效生防菌株奠定基础。

参 考 文 献：

[1]贾栗， 陈疏影， 翟永功， 等. 近年国内外植物内生菌产生物活性物质的研究进展[J]. 中草药， 2007， 38（11）：1750- 1754.

[2]Herre E A， Mejía L C， Kyllo D A， et al. Ecological implication of anti-pathogen effects of tropical fungal endophytes and mycorrhizae[J]. Ecology， 2007， 88（3）： 550-558.

[3]李端， 郭利伟， 郭伟云， 等. 抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物的研究[J]. 安徽農业科学， 2009， 37（16）： 7508-7509， 7515.

[4]陈雪英， 都晓伟， 李滨. 内生菌与药用植物活性成分相关性研究进展[J]. 国外医药（植物药分册）， 2008， 23（2）： 47-51.

[5]Schulz B， Boyle C. The endophytic continuum[J]. Mycological Research， 2005， 109（6）： 661-686.

[6]Wilson D. Endophyte： the evolution of a term， and clarification of its use and definition[J]. Oikos， 1995， 73（2）： 274-276.

[7]石晶盈， 陈维信， 刘爱媛. 植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J]. 生态学报， 2006， 26（7）： 2395-2401.

[8]严菊芬， 王素萍， 齐宁波， 等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2012， 24（s1）： 176-181.

[9]陈利军， 陈月华， 史洪中， 等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 安徽农业科学， 2006， 34（11）： 2438-2440.

[10]华永丽， 欧阳少林， 陈美兰， 等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术-中医药现代化， 2008， 10（4）： 105-111.

[11]黎万奎， 胡之璧. 内生菌与天然药物[J]. 中国天然药物， 2005， 3（4）： 193-199.

[12]白志强， 林秀萍， 刘永宏. 内生拟盘多毛孢菌化学成分研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2013， 25（5）： 706-715， 697.

[13]杨春平， 陈华保， 吴文君， 等. 植物内生真菌次生代谢产物的多样性及潜在应用价值[J]. 西北农业学报， 2005， 14（2）： 126-132.

[14]Stierle A ， Strobel G A ， Stierle D B . Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae， an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science， 1993， 260（5105）： 214-216.

[15]Stone R . Gary strobel profile： biologist gets under the skin of plants and peers[J]. Science， 2002， 296（5573）： 1597-1599.

[16]易官美， 邱迎君. 榧树的研究现状与展望[J]. 资源开发与市场， 2013， 29（8）： 844-847.

[17]马长乐， 胥辉， 白琼， 等. ICP-OES法测定云南榧树不同部位矿质元素[J]. 东北林业大学学报， 2012， 40（7）：30- 31， 36.

[18]马长乐， 黄晓霞， 艾星梅， 等. 云南榧内生菌的分离及抗植物病原菌活性筛选[J]. 西部林业科学， 2014， 43（4）： 10-14.

[19]谢津， 李靖， 黄伟， 等. 云南榧内生放线菌FTY2的分子鉴定及其抑菌活性[J]. 贵州农业科学， 2015， 43（3）： 102-105.

[20]劉蕴哲， 何劲， 张杰， 等. 植物内生真菌及其活性代谢产物研究进展[J]. 菌物研究， 2005， 3（4）： 30-36.

[21]杨瑞先， 葛晓燕. 植物内生细菌生物学作用研究进展及应用前景[J]. 洛阳大学学报， 2006， 21（4）： 78-81.

[22]李春美， 邓明， 谢笔钧. 柚皮提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用的初步研究[J]. 食品工业科技， 2004， 25（5）： 64- 66.

[23]张玉博， 庄文颖. 对峙培养条件下木霉拮抗植物病原真菌能力的评价[J]. 菌物学报， 2017， 36（9）： 1251-1259.

[24]杨力明. 哈茨木霉几丁质酶V基因等克隆及其特性研究[D]. 哈尔滨： 哈尔滨工业大学， 2008.