HPLCUV法测定植物甾醇中3种甾醇单体的含量

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(1.江南大学食品学院,国家功能食品工程技术研究中心,江苏无锡 214122; 2.江苏科鼐生物制品有限公司,江苏泰兴 225400)

植物甾醇是一种以环戊烷全氢菲为基本骨架的天然活性化合物[1],通常包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等,其中豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇在植物中含量最高,其结构通式见图1。植物甾醇作为植物中的活性成分之一,广泛存在于各类植物种子、坚果和植物油中,具有降低机体胆固醇水平、降低心脏疾病风险、抗癌、消炎和抗氧化等生理功能[2-4]。1999年FDA批准了植物甾醇及其酯类使用“健康声称”标签[5],2004年植物甾醇经欧盟获批在特定食品中使用[6],2010年我国卫生部正式批准并认证植物甾醇为新资源食品。目前,分离纯化植物甾醇的原料来源主要是植物油脱臭馏出物和妥尔油[7]。近年来,植物甾醇在食品、医药和化工等领域受到广泛关注与高度重视,全球植物甾醇的需求量呈逐年递增的趋势[8]。因此,建立一种灵敏准确、快捷简便的检测方法来测定植物甾醇的含量,对分析此类活性物质具有重要意义。

图1 植物甾醇及甾醇单体的分子结构式Fig.1 Molecular structural formula of phytosterol and corresponding individual sterol

植物甾醇的检测主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和液相质谱联用等方法[9]。薄层色谱法主要用于定性分析,在甾醇单体的定量方面存在灵敏度差、操作繁琐和显色不稳定等缺陷,使植物甾醇无法达到准确定量分析的要求[10];气相色谱法或气质联用技术虽分辨率较高,且热稳定性好,但缺点在于GC需要BSTFA+TMCS等硅烷化试剂对样品进行衍生化预处理,试剂毒性大且检测成本高,较高的操作温度会在测量过程中破坏样品分子结构[11-12]。目前,液相质谱联用技术(HPLC-MS)作为一种灵敏度更高且选择性更强的检测手段,正在为植物甾醇的检测提供一种新的可能[13-15],但HPLC-MS仪器设备购置及维护成本高昂,对操作人员要求较高,且分析繁琐[16]。高效液相色谱法只需皂化和萃取等手段,从目标物中分离纯化得到植物甾醇后即可直接进样,无需对样品进行衍生化,且能与蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,ELSD)、紫外可见光检测器(ultraviolet detector,UV)等检测器联用,其中紫外检测器作为最常用的检测器之一,具有灵敏度高,准确度高、稳定性好等优点[17-18],由于菜油甾醇和豆甾醇只在C-22位和C-24位上存在结构差异,两者之间产生的极性中和效应,使大多流动相溶剂、洗脱时无法消除其共洗脱效应。Zhang等[19-20]采用乙腈:异丙醇:水配比作为流动相,豆甾醇和菜油甾醇共洗脱,以同一个色谱峰的形式被检出;Sanchez-Machado等[21]将乙腈和甲醇按一定比例作为流动相进行HPLC检测,结果发现豆甾醇和菜油甾醇产生共洗脱效应,仍无法较好地分离。

本研究采用紫外高效液相法(HPLC-UV),针对市售的不同种类混合植物甾醇,建立一种准确可靠的分析方法。本文通过优化流动相配比、柱温和流速等液相色谱条件,使菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇达到基线分离,并对检测方法的线性关系、检出限、定量限、精密度和回收率等方法学考察指标进行探究,采用HPLC-UV法可作为植物甾醇快速定量分析的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆甾醇(大豆油脱臭馏出物深加工产物) 源于江苏泰州、福建龙岩、浙江兰溪;木甾醇(妥尔油深加工产物,市售) 产自江苏泰州;标准品豆甾醇、β-谷甾醇(纯度>95%) 购于Sigma-Aldrich公司;标准品菜油甾醇(纯度>95%) 购于成都市普思生物科技股份有限公司;乙腈、甲醇(均为色谱纯) 购自百灵威科技有限公司;95%乙醇等其他试剂及药品(均为分析纯) 购自国药集团化学试剂有限公司。

EL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金坛市荣华仪器有限公司;KH-250DB数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;RT10多点磁力搅拌器 德国IKA公司;QGC-12T氮气吹干仪 上海泉岛公司;循环水多用真空泵 上海泸西分析仪器有限公司;Waters 1525高效液相色谱仪(HPLC-UV) Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 分别准确称量10 mg豆甾醇、10 mgβ-谷甾醇、5 mg菜油甾醇标准品,置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,得混合标准储备液。准确吸取混合标准储备液50、100、200、400、800、1000 μL,将甲醇用氮吹仪吹干后,再用乙腈溶解,分别于10.0 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度线,得到浓度为5、10、20、40、80、100 μg/mL的豆甾醇和β-谷甾醇标准系列溶液,浓度为2.5、5、10、20、40、50 μg/mL的菜油甾醇标准系列溶液。所有的标准溶液置于棕色容量瓶内,4 ℃保存,用于HPLC色谱分析。豆甾醇和β-谷甾醇标准曲线的浓度范围为5～100 μg/mL之间,菜油甾醇标准曲线的浓度范围为2.5～50 μg/mL之间。以3种甾醇单体的质量浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,进行回归分析,得到回归方程以及相关系数。

1.2.2 HPLC色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry® C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);Waters 2489紫外可见光检测器,检测波长208 nm;等度洗脱;进样量20 μL;外标法定量。本实验考察100%甲醇、100%乙腈作为流动相、流动相中添加不同比例水(2%、4%、6%、8%、10%)、不同柱温(25～40 ℃)、不同流速(0.5～1.5 mL/min)对3种植物甾醇单体的分离效果。

1.2.3 回收率和精密度 取均一的大豆甾醇样品,分为3组,分别将10、20、40 μg的菜油甾醇、20、40、80 μg的豆甾醇和20、40、80 μg的β-谷甾醇添加进菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的本底值分别为47、47、81 μg的大豆甾醇样品中,构成高、中、低3个加标组及1个空白对照组,重复测定5次,其中加标试验组测得量减去未加标试验组本底值所得结果与加标试验组的理论加标量之比即为样品回收率。取回收率实验中高、中、低3个加标组在同一天内重复进样5次,计算日内精密度;在连续3 d内每天重复进样3次,计算日间精密度,均以RSD表示[22]。

1.2.4 样品测定 取3种不同产地大豆甾醇和1种木甾醇,分别称取10 mg,置于100 mL容量瓶中,以乙腈为溶剂并在常温下超声使溶解定容,每批做3组平行,按照1.2.2所述色谱条件下进样测定,根据1.2.1给出的菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的标准曲线,按外标法计算3种甾醇单体的含量。

1.3 数据处理

所有实验重复3～5次,数据计算均在Microsoft Excel 2013中完成。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-UV色谱条件的优化结果

其中以100%甲醇为流动相时,3种甾醇单体无法有效分离并以一个色谱峰的形式在保留时间10 min时出峰;而以100%乙腈为流动相时,β-谷甾醇能较好地分离出来,豆甾醇和菜油甾醇虽能以两个色谱峰的形式出峰,但分离度低且两峰无法达到基线分离,这是由于反相柱中溶剂的洗脱能力随样品极性的增强而减弱,甲醇的极性强于乙腈[21],故采用洗脱能力更强的乙腈更利于豆甾醇和菜油甾醇的分离。通过添加不同比例水来调节流动相的极性,最终发现乙腈∶水比例为98∶2时,豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇均能较好地分离且达到基线分离。

流动相确定后,为使3种甾醇单体达到最佳的分离度，对柱温及流速进行了优化。25、30 ℃时色谱峰的峰宽较大,分离度较高,但检测时间过长,且25 ℃色谱峰甚至出现拖尾现象;40 ℃时色谱峰峰宽较小,豆甾醇和菜油甾醇分离效果不好;30 ℃时色谱峰峰形最佳,且检测时间适中,因此选择30 ℃为最佳柱温。0.5 mL/min流速时,3种甾醇单体分离效果较好,但检测时间将近50 min;1.5 mL/min时检测时间缩短至30 min以内,但由于流速较快,甾醇单体在色谱柱内被更快地洗脱下来,豆甾醇和菜油甾醇的色谱峰之间分离度减低,无法达到较好的分离效果;1.0 mL/min时甾醇单体各组分分离效果最佳,且检测时间约为38 min,所以选择1.0 mL/min为最优流速。由图2可知,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇在1.2.2色谱条件下的保留时间分别为29.3、31.1、36.1 min,且均能够达到基线分离,能够较好地进行甾醇的定量分析。

图2 植物甾醇混合标准样品的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of phytosterol mixed standard sample注:1.菜油甾醇;2.豆甾醇;3.β-谷甾醇。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系、检出限和定量限 在选定的色谱分析条件下,对1.2.1中的混合标准系列溶液进行分析。表1给出了3种甾醇单体的线性关系、检出限和定量限。3种甾醇均保持良好的线性关系,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的线性范围为2.52～50.30、5.08～101.60、5.10～102.00 μg/mL,线性相关系数达到0.9971～0.9991,能够满足定量分析的要求,检出限和定量限分别由3倍和10倍信噪比得来,分别为2.5、8.3 μg/mL。

表1 3种甾醇单体的线性关系、检出限及定量限(n=3)Table 1 Linearity and limit of detection and quantitation of 3 kinds of individual phytosterol(n=3)

2.2.2 日内精密度和日间精密度 在实验方法条件下,大豆甾醇中的3种甾醇单体的日内精密度介于0.06%～3.06%,从低至高水平的日内精密度结果发现,随着加标浓度的提升,日内精密度的RSD值也不断上升,推测可能是目标物浓度的上升对色谱柱柱效或流动相对目标物的洗脱能力产生了一定的影响;日间精密度介于1.56%～6.61%,表明该方法对植物甾醇的测定具有良好的精密度。

表2 HPLC方法的日内精密度(n=5)和日间精密度(n=3)(%)Table 2 Intra-day(n=5)and inter-day(n=3)precision of HPLC method(%)

2.2.3 加标回收率 按1.2.2色谱条件进行测定,以进样5次测定计算平均值,结果见表3。由表3可知,菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的加样回收率分别在92.74%～98.29%、99.66%～106.25%、93.87%～100.49%之间,RSD介于2.91%～3.57%,表明该方法具有较高的回收率,回收结果准确可靠。

表3 3种甾醇单体的加样回收率(n=3)Tbale 3 Recovery of 3 kinds of individual phytosterol

2.2.4 样品测定 大豆甾醇是以植物油精炼过程的脱臭馏出物为原料提取得到的,而木甾醇来源于造纸业副产物妥尔油,两种原料均为植物甾醇的重要原料来源[23]。目前,国内企业多以大豆油精炼过程的脱臭馏出物为原料生产植物甾醇,即大豆甾醇;而以妥尔油为原料生产的植物甾醇,即木甾醇,国内企业涉及较少,但由于妥尔油来源广泛且其植物甾醇含量较高,且国外早已将妥尔油作为植物甾醇提取的重要原料来源之一[23]。因此分别选取国内3种不同产地大豆甾醇和1种木甾醇进行检测,对本检测方法能否准确测定植物甾醇产品的含量及其对不同种类植物甾醇检测的普遍适用性进行检验。

由表4可知,除产自福建龙岩的大豆甾醇中菜油甾醇和豆甾醇含量差异较大以外,其余两产地大豆甾醇中菜油甾醇和豆甾醇含量均较为接近,而β-谷甾醇的含量较高,为307.15～432.45 mg/g;木甾醇主要是通过皂化、蒸馏、冷却和结晶等工序从妥尔油中提取分离所得,木甾醇中豆甾醇含量非常低,仅小于5%,但β-谷甾醇在木甾醇中的含量最高,为(685.10±7.55) mg/g,其含量远高于豆甾醇在大豆甾醇中的含量,说明在对混合甾醇的进一步精制和分离纯化中,木甾醇更适于作为分离纯化出高纯度β-谷甾醇单体的原料,而大豆甾醇中3种甾醇单体则适用于多种甾醇单体的分离富集,以期获得附加价值更高的甾醇单体。

表4 不同产地的混合甾醇中3种甾醇单体的含量(n=3)(mg/g)Table 4 Content of 3 kinds of individual phytosterol of mixed phytosterol from different regions(n=3)(mg/g)

3 结论

本研究建立了测定不同混合甾醇中3种甾醇单体的含量的方法。通过流动相优化实验,确定了乙腈和水在98∶2的比例下等度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃的最佳色谱条件,不仅使3种甾醇单体在38 min内达到基线分离,且大大缩短了保留时间。经过检测方法学的考察,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的线性关系良好,相关系数r分别为0.9971、0.9989、0.9991,线性范围分别为2.52～50.30、5.08～101.60、5.10～102.00 μg/mL;其中,日内精密度和日间精密度分别介于0.06%～3.06%和1.56%～6.61%之间,说明该方法精密度较高;同样,回收率较高并介于92.74%～106.25%,本方法对4种植物甾醇中3种甾醇单体的含量进行检测,发现其中大豆甾醇和木甾醇中3种甾醇单体的含量组成差异较大,木甾醇中β-谷甾醇含量为(685.10±7.55) mg/g,远高于豆甾醇在大豆甾醇中的含量,因此木甾醇更适于作为高纯度β-谷甾醇单体分离纯化的原料。

综上,本文建立了HPLC-UV法对混合甾醇中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的定量方法,具有灵敏度高、稳定性好和操作简便等特点,能够较好地展现出不同植物甾醇中3种甾醇单体的分布规律,满足准确定量3种甾醇单体含量的检测要求。