辉光放电等离子体对葡萄汁中棒曲霉素的降解作用

马亚云, 龙海涛, 杜明远, 薛华丽, 南米娜, 付国瑞, 毕 阳, 蒲陆梅*

1.甘肃农业大学理学院, 兰州 730070;2.甘肃农业大学食品科学与工程学院, 兰州 730070

葡萄(Vitisvinifera)是维生素和矿物质元素的极佳来源，近年来，葡萄汁等葡萄产品的消费量持续增长。葡萄作为世界上种植面积最大的水果作物之一，其中大部分被用于生产葡萄汁及深加工，然而，在葡萄的生产及贮存过程中经常检测到棒曲霉素(patulin，PAT)，其为棒曲霉产生的次级代谢产物[1]，既具有致癌、致畸作用，又具有免疫毒性[2]，会给人体带来严重的健康问题。世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会设定PAT每日最大摄入量为0.4 mg/kg[3]；欧盟规定在婴幼儿苹果制品中PAT应低于10 μg/kg[4]；而我国GB 2761-2017《食品安全国家标准——食品中真菌毒素限量》中规定水果、饮料及其制品中的PAT检测限为50 μg/kg[5]。由此可见，寻找可有效降解食品中棒曲霉素的方法至关重要。

为了降低食品中棒曲霉素的含量，除了对加工原料进行清洗防腐处理，研究人员还开展了大量的研究工作。如利用活性炭、大孔树脂、壳聚糖或硫脲改性的壳聚糖树脂(thiourea modified chitosan resin，TMCR)[6,7]等吸附污水或水溶液中的污染物；近年来兴起的印记材料也可用于对苹果汁进行吸附澄清处理，24 h即可使苹果汁中棒曲霉素的含量降低80%[8]。但上述物理吸附只是转移了苹果汁中的棒曲霉素，并未将其实质降解或消除。辐照处理也可以减少苹果汁中PAT的含量，但高辐照强度会破坏苹果汁的品质。化学降解法虽在一定程度上消除了PAT的毒性，但所用试剂及衍生物亦可能严重影响苹果汁的品质，同时会对环境造成污染[9]。生物处理方法中，附生酵母(Rhodosporidiumkratochvilovaestrain LS11)既可控制苹果中的棒曲霉，又对其产生的棒曲霉素具有生物降解能力，处理3 d后，可将90%以上的棒曲霉素降解，但其转化产物(desoxypatulinic acid)仍继续存在[10]，所以目前还难以得到广泛应用。

辉光放电等离子体(glow discharge plasma，GDP)是一种新兴的降解有机污染物的方法[11]，近年来引起了研究人员的广泛关注。该方法将GDP的高能活性粒子作用于具有特定基团的有机物，通过破坏有机物分子中的化学键而使其逐步降解，最终将有机物降解为CO2和H2O，对于难降解的有机物具有较好的效果[12,13]，如其在有机染料[14]、苯酚和多取代酚[15,16]、苯胺和多取代苯胺[17,18]的降解中展现出了范围广且效率高的特点。然而，利用GDP直接针对葡萄汁中PAT的降解及其对葡萄汁品质的影响的相关研究鲜见报道。

因此，本研究以不同电压、处理时间、PAT初始浓度及催化剂为因素，研究GDP对葡萄汁中棒曲霉素的降解工艺及动力学特征，并对GDP处理前后葡萄汁的营养品质进行比对分析，旨在为研究利用GDP降解果汁饮料中棒曲霉素提供一定的理论依据，同时对果汁的饮用安全也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1材料与试剂 “巨峰”紫葡萄于2017年7月采自甘肃省天水市麦积区社棠镇；棒曲霉素标准品购于北京泰乐祺科技有限公司；福林酚购自合肥博美生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2仪器与设备 3K-15高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DH1722-6高压直流电源(北京大华无线电仪器厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司)；RE2000B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；FL2200-2高效液相色谱仪(浙江福立分析仪器有限公司)；PHS-3C pH计(上海雷磁仪器厂)；722N可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；2W型阿贝折光仪(上海光学仪器五厂)。

1.1.3辉光放电装置 辉光放电试验装置的构造如图1所示，该装置主要包括反应器和直流电源2个部分。反应器分别由直径为0.5 mm的铂丝构成阳极，直径为1.0 cm的碳棒构成阴极。反应过程中用水浴控制温度，用磁力搅拌器进行搅拌。

图1 GDP试验装置示意图Fig.1 Experimental apparatus of GDP.

1.2 样品制备

1.2.1棒曲霉素标准品 取1 mg的棒曲霉素标准品用乙腈溶解并定容至10 mL，得到100 mg/L的PAT标准储备液，于-20℃保存，备用。

1.2.2葡萄汁的制备 选取颗粒完整、大小一致的“巨峰”紫葡萄，制备流程为：清洗→去梗、去皮→榨汁→3层纱布过滤→果胶酶酶解(加酶量0.05 g/L，于45℃处理2 h)→离心(4℃、6 000 r/min离心5 min)→抽滤，并将最终获得的葡萄汁于4℃保存，备用。

1.2.3含棒曲霉素葡萄汁的制备 分别将3 mL、5 mL、7 mL 100 mg/L的PAT移至100 mL的容量瓶中，用1.2.2中制备的葡萄汁进行定容，分别得到3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L的含PAT葡萄汁，于4℃保存，备用。

1.3 PAT标准曲线绘制

将100 mg/L的PAT标准储备液分别用pH 4.0的乙酸稀释成浓度为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L以及10 mg/L的PAT溶液，再利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)进行检测，以PAT浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制PAT标准曲线，得峰面积与PAT浓度为线性关系：y=89 720x+5 896.7，相关系数R2=0.997。

1.4 电流电压特征曲线测定

取20 mL含PAT(初始浓度为5 mg/L)的葡萄汁于GDP反应器中，测定辉光放电发生时电流随电压的变化曲线。根据辉光放电稳定状态，确定适用于GDP降解葡萄汁中PAT的电压与电流。

1.5 PAT降解工艺优化

准确量取10 mL含PAT的葡萄汁于GDP反应器中，在原始工艺条件(电压560 V、PAT初始浓度5 mg/L、处理时间3 min、不添加催化剂)的基础上，依次改变其中1个因素，同时保持其他条件不变，即在不同的电压、处理时间、PAT初始浓度和催化剂的条件下，以降解率为指标，进行单因素试验。其中，电压设置为480 V、520 V、560 V、600 V、640 V；时间设置为2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；PAT初始浓度设置为1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L；催化剂分别采用100 mg/L硫酸亚铁、100 mg/L过氧化氢和100 mg/L抗坏血酸(ascorbic acid，AA)。降解率计算公式如式1。

(1)

式1中C0为初始PAT浓度，mg/L；Ct为降解t时间后的PAT浓度，mg/L。

在单因素试验的基础上，分别筛选3个水平进行L9(34)正交试验，综合考虑降解电压(A)、处理时间(B)、PAT初始浓度(C)和催化剂(D)对葡萄汁中的PAT降解的影响，试验因素水平见表1。

1.6 PAT提取及检测

参照GB 5009.185-2016[19]并稍作修改，将GDP处理后的含PAT(初始浓度为5 mg/L)葡萄汁用20 mL蒸馏水转移至125 mL的分液漏斗中，用30 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液；再加入0.2 mL冰乙酸于40℃下旋转蒸发至干，最后用1.0 mL乙酸缓冲溶液(pH 4.0)溶解残留物，经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC测定。

测定方法参照GB 5009.185-2016[19]并稍作修改。色谱柱：C18反相柱(250 nm×4.6 nm×5 μm)；检测器：紫外检测器；波长：276 nm；流动相：乙腈∶水(1∶9，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.7 棒曲霉素降解动力学

为了研究GDP降解PAT的动力学过程，分别检测经GDP处理0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min后葡萄汁中PAT的浓度，并分别拟合零级、一级和二级动力学曲线，以分析其降解动力学特点。

1.8 葡萄汁品质测定

准确量取10 mL含5 mg/L PAT的葡萄汁于GDP反应器中，在优化后的最佳工艺条件下处理，随后分别检测葡萄汁的以下8项指标，以未经处理的含5 mg/L PAT的葡萄汁为对照。透光率：参考吴汉东[20]分光光度法测定680 nm处透光率；浊度：利用GDS-3A光电式GDS-3A光电式浑浊度仪测定；总酸：参照GB/T 12456-2008[21]中的氢氧化钠滴定法测定；还原性糖：采用3,5-二硝基水杨酸法测定；pH：采用PHS-3C型pH计测定；可溶性固形物(TSS)：采用阿贝折光仪测定；总酚：参照Luciano等[22]的福林酚比色法测定；总黄酮：参照Abid等[23]的硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定。

表1 GDP降解葡萄汁中PAT正交试验方案Table 1 Orthogonal experimental scheme of patulin in grape juice degraded by GDP.

1.9 数据处理

每组试验均进行3次重复，分别利用Excel 2010进行数据计算、Origin 9.0绘图、SPSS 16.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 电流电压特征曲线

以葡萄汁为电解液的GDP降解PAT的电流-电压特征曲线如图2所示，从中可以看出，当电压处于0～150 V时，电流与电压呈线性关系，电流随电压的变化遵循欧姆定律，在此阶段发生的是水的电解；当电压升高至150～450 V之间时，随着电压的增大，在两电极的表面不断产生大量的气泡，电流呈现不稳定变化，这可能是焦耳热的作用所致；当电压高于450 V时，电流与电压又呈正相关性，在阳极的表面开始出现黄色的辉光，且辉光的强度随着电压的增大而变得更加剧烈。当电压调节至560 V时，辉光放电现象非常明显且比较稳定。因此，选择560 V电压为降解葡萄汁中PAT的电压，此时电流范围为85～94 mA。

图2 电流-电压特征曲线Fig.2 The characteristics curve of current-voltage.

2.2 GDP对PAT的降解工艺条件

利用HPLC分别对5 mg/L PAT标准溶液、葡萄汁和含PAT(初始浓度为5 mg/L)的葡萄汁进行测定。由图3可知，葡萄汁的基本色谱峰对PAT的测定基本无干扰，葡萄汁中的PAT也出现标准色谱峰(t=9.556)，经与PAT标准溶液(t=9.561)对比重现性较好。因此，本研究所用方法能够准确地定性、定量分析PAT含量的变化。

2.2.1电压对PAT降解效果的影响 当葡萄汁中PAT初始浓度为5 mg/L时，在不同电压下，GDP对葡萄汁中PAT处理3 min后的降解效果如图4所示。随着电压的升高，GDP对PAT的降解率呈上升趋势；电压为480 V和520 V时，GDP对葡萄汁中PAT的降解率无显著差异(P>0.05)；电压升至560 V和600 V时，较520 V时，GDP对葡萄汁中PAT的降解效果分别提高了21.27%和23.78%；而当电压继续升高至640 V时，PAT的降解率无显著变化(P>0.05)。

这说明，在一定反应时间内，随着电压的升高，反应体系中产生的活性物质(如·OH、·O、H2O2等)逐渐增多，从而使PAT的降解率得到了显著提高。该结果与郑继东等[24]的研究结果一致，即随着电压的增加，辉光增强，PAT的降解率也逐渐增大。

2.2.2初始浓度对PAT降解效果的影响 在560 V条件下，利用GDP对含不同初始浓度PAT的葡萄汁分别处理3 min。由图5可知，当PAT初始浓度为1 mg/L时，GDP对PAT的降解率为48.74%，显著低于其他浓度的降解率(P<0.05)。当初始浓度为3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L时，GDP对PAT的降解率无显著差异(P>0.05)，均在57%左右。

究其原因，在一定浓度范围内，不同初始浓度的PAT不影响GDP对其的降解速率。同样的，巩建英[25]研究的GDP对甲基橙降解作用的结果也表明，在90 min内，GDP对不同浓度甲基橙的降解率相同。但Pu等[26]研究的GDP对不同浓度T-2毒素的降解率结果表明，在4 min内GDP对初始浓度为38 mg/L的T-2毒素的降解率要比初始浓度为13 mg/L的T-2毒素的降解率高出6%，在相同时间内反应物初始浓度较高时，T-2毒素的去除率较高。由此可知，只有在一定浓度范围内，PAT的初始浓度不影响GDP对其的降解速率；且当PAT的浓度达到一定量时，反应体系中产生的·OH更快的被消耗，反应向有利于PAT降解的方向进行。

图3 棒曲霉素HPLC色谱图Fig.3 The HPLC chromatogram of patulin.

图4 电压对GDP降解棒曲霉素的影响Fig.4 Effect of voltages on the degradation of patulin by GDP.

图5 初始浓度对GDP降解棒曲霉素的影响Fig.5 Effect of initial concentrations on the degradation of patulin by GDP.

2.2.3时间对PAT降解效果的影响 在560 V条件下，利用GDP对含PAT(初始浓度为5 mg/L)的葡萄汁进行不同时间的处理。结果如图6所示，随着时间的增加，GDP对PAT的降解率逐渐增大，当处理时间为2 min、4 min和6 min时，GDP对PAT的降解率均具有显著差异(P<0.05)，GDP处理10 min后，葡萄汁中PAT的降解率已达到96%，与处理6 min、8 min时的降解率均无显著差异(P>0.05)。由于GDP处理时间和棒曲霉素初始浓度2个因素之间的相互作用对降解率的影响较大，且二者在GDP处理前5 min之内相互作用最显著(数据未发表)，因此，本研究在后续的正交试验中选择1 min、3 min 和 5 min作为时间因素的3个水平。

图6 时间对GDP降解棒曲霉素的影响Fig.6 Effect of time on the degradation of patulin by GDP.

分析其原因，随着GDP处理时间的增加，反应体系中产生了更多的·OH、·O、H2O2，与PAT结合并对其造成破坏，从而使降解率增大。这与孙艳等[27]利用GDP处理苹果汁中PAT的研究结果基本一致，本试验研究的葡萄汁的pH约为3.35，使PAT更易被氧化。

2.2.4催化剂对棒曲霉素降解效果的影响 在560 V条件下，添加不同催化剂，利用GDP对含5 mg/L PAT的葡萄汁处理3 min。由图7可知，添加催化剂的处理组的PAT降解率均显著高于未添加催化剂的对照组(P<0.05)，添加硫酸亚铁、过氧化氢和抗坏血酸组的PAT降解率比未添加催化剂的对照组分别提高了25%、34%和26%。不同催化剂对GDP的催化效果有所不同，其中以H2O2为催化剂的降解效果最佳，但3种催化剂对GDP降解PAT的催化效果之间无显著差异(P>0.05)。

图7 催化剂对GDP降解棒曲霉素的影响Fig.7 Effect of catalyst on the degradation of patulin by GDP.

这可能是因为，H2O2不仅加快了活性离子的产生速率，还通过自身的电离产生·OH、O2、HO2·等活性物质，增加了反应体系活性物质的数量，从而最大程度的提高了GDP对PAT的降解率。抗坏血酸和Fe2+均是通过加快反应体系中活性离子的产生速率，从而提高PAT的降解率。此外，Fe2+还可与反应体系中的H2O2发生Fenton反应，加快了·OH的产生，使PAT的降解率得到了提高，这与Fe2+催化GDP降解的有关报道[28]结果一致。Fe2+催化历程如下：

Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-

(1)

Fe3++H2O2→Fe2++HO2·+H+

(2)

HO2·+H2O2→H2O+O2+·OH

(3)

2.2.5正交实验结果 从表2可知，时间因素(B)的极差R为44.3，表明时间对棒曲霉素的降解率影响最大，4种因素的主次顺序是B>D>C>A，即时间、催化剂、初始浓度、电压。4种因素对PAT的降解均有显著影响。实验结果表明，在A3B2C1D2工艺条件下，即电压600 V、时间3 min、PAT初始浓度3 mg/L、催化剂为H2O2时，GDP对葡萄汁中的棒曲霉素的降解效果最佳。由于560 V与600 V对PAT降解效果无显著差异，并基于节能及操作安全的原则，将电压560 V、时间3 min、初始浓度3 mg/L、催化剂为H2O2作为GDP降解棒曲霉素的最佳条件。

表2 GDP降解葡萄汁中棒曲霉素正交实验结果Table 2 Orthogonal test results of patulin in grape juice degraded by GDP.

对上述最佳条件进行验证试验，得到GDP对PAT的降解率为98.9%±0.05%，优化组合条件下PAT降解率高于正交实验中降解率最高的6号试验条件下PAT的降解率。

2.3 棒曲霉素降解动力学特征

为了研究GDP降解葡萄汁中PAT的动力学过程，分别对经GDP处理不同时间的葡萄汁中PAT的浓度变化进行动力学曲线拟合，结果如表3所示。Ct为GDP处理t时间后PAT的浓度，C0为GDP处理前PAT的初始浓度。

表3 GDP降解葡萄汁中PAT动力学曲线拟合结果Table 3 The kinetics curve fitteing results of patulin in grape juice by GDP.

从表3可知，在一级动力学曲线的拟合中相关系数高达0.989 0，大于零级和二级反应动力学的拟合相关系数。该结果表明辉光放电等离子体对葡萄汁中PAT的降解过程符合一级反应动力学，即GDP降解PAT的速率与PAT的浓度成正比，且该结果与相关文献报道[26,29]结果一致。

2.4 GDP降解对葡萄汁品质的影响

浊度、还原糖含量、总酸、总酚及总黄酮等是衡量葡萄汁品质的重要指标。因此，通过研究在最佳工艺条件下GDP处理前后葡萄汁营养品质的变化情况，分析GDP对葡萄汁品质的影响。

在最佳工艺条件下，GDP对葡萄汁品质的影响如表4所示。GDP处理前后葡萄汁中的还原糖和TSS均无显著变化；表中数据显示，GDP处理后葡萄汁的pH下降了0.05，而总酸增加了0.445 g/L，但两者与GDP处理前相比均无显著差异(P>0.05)。这可能是由于GDP处理后使葡萄汁中更多的有机酸溶解出来[30]，从而使总酸浓度增加、pH降低。GDP处理后葡萄汁的透光率增加了1.1%，而浊度减少了3.6%，两者与GDP处理前相比均无显著差异(P>0.05)，表明GDP处理可以在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。GDP处理后葡萄汁的总酚和总黄酮均有不同程度的下降，但无显著差异(P>0.05)，说明GDP处理不会对葡萄汁的酚类和黄酮产生影响。综上所述，GDP处理可以在一定程度上提高葡萄汁的澄清度，又不会导致其总酚、总黄酮、总还原糖、总酸、TSS发生显著变化。

表4 GDP对葡萄汁品质的影响Table 4 The effect of GDP on the quality of grape juice.

3 讨论

本研究表明，辉光放电等离子体可以有效降解葡萄汁中的棒曲霉素；GDP降解葡萄汁中PAT的最佳工艺条件为电压560 V、时间3 min、初始浓度3 mg/L、以100 mg/L H2O2为催化剂，该条件下，GDP对PAT的降解率高达98.8%；GDP降解葡萄汁中PAT符合一级动力学特征。此外，葡萄汁理化指标评价结果表明，GDP处理对葡萄汁的还原糖、可溶性固形物、pH、总酸、总酚及总黄酮没有显著影响，且还可在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。

研究辉光放电等离子体对果汁中PAT的降解效果时，为了保证葡萄汁品质不受影响，选择合适的处理条件至关重要。本研究结果与孙艳[31]筛选到的GDP降解苹果汁中PAT的最佳工艺条件相比，电压及处理时间一致，而在PAT初始浓度上存在差异，可能是反应体系媒介不同所致。另外，本研究对GDP降解葡萄汁中PAT的动力学拟合结果与Pu等[26]利用GDP降解T-2毒素符合一级降解动力学特征一致，说明GDP降解PAT的速率与PAT的浓度成正比。同时，通过比对分析GDP处理前后葡萄汁理化指标的变化情况，发现GDP处理对葡萄汁的还原糖、可溶性固形物、pH、总酸、总酚及总黄酮无显著影响，且还可在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。相比之下，常规的食品加工方法会使食品中的总黄酮、总酚等的含量显著降低(高达46%)[32]。由此可见，GDP技术处理不仅对毒素的降解效果较好，而且不会影响葡萄汁品质，有利于商业开发并且对消费者有益。

与传统的毒素处理方法相比，GDP降解PAT具有操作简便、快速及无二次污染等优点，具有更高的实际应用价值。本研究已初步优化了GDP技术对葡萄汁中棒曲霉素的降解工艺，分析了其动力学特征，同时验证了GDP在高效降解毒素的同时，对葡萄汁品质无影响。为GDP技术应用于果汁中毒素的降解提供了一定的理论依据，同时进一步拓宽了GDP技术的应用范围。但关于GDP技术对PAT在果汁中的详细降解机理及其对果汁抗氧化性等其他性质的影响尚不清楚，将是后续深入研究的重点。