有氧运动对脑小血管病大鼠执行功能的效果

王茹，刘楠，李卫萍，赵弘轶，杜菊梅，黄勇华

1.中国人民解放军总医院第七医学中心神经内科，北京市100700；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳市712000

脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSⅤD)作为一种日益增长的医学和社会经济负担而受到关注。它能够引起全世界约1/5的脑卒中[1]，是老年人致残和致死的重要原因[2]。进行性的认知执行功能下降与老年人群中近一半的痴呆相关[3]。CSⅤD引起认知功能障碍主要表现为执行功能下降，早期诊断及有效干预能够防治CSⅤD相关的认知障碍[4]。越来越多的证据表明，体育锻炼对多个认知领域有益，特别是执行功能[5]；此外，运动还可以减缓正常老化中的认知功能下降和神经变性[6]。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一种对脑和周围组织发挥多种效应的蛋白质[7]，在神经元生长、分化、再生和凋亡中发挥重要作用[8]。在神经发生过程中，BDNF通过激活下游原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)促进神经干细胞生长[9]，并具有调节突触的作用[10]。BDNF在神经元细胞的树突生长和形态学方面也发挥重要作用[11]。

有氧运动可增加大鼠和小鼠齿状回的神经发生[12]；限制大鼠运动可损害神经发生，并降低BDNF水平[13]。运动可恢复小鼠海马受损的神经发生水平，并且与BDNF表达增强相关[14]。BDNF参与有氧运动诱导的神经发生和神经传导，可以调节动物和人类认知，在神经可塑性方面也起重要作用[15]。

本研究探讨有氧运动对CSⅤD大鼠BDNF/TrkB信号通路的影响，以及海马神经元增殖分化和执行功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体质量(350±12.8)g，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，动物许可证号SCXK(京)2016-0002。饲养室温度20～25℃，相对湿度50%～65%，环境保持相对安静，12 h光照黑暗交替，自由摄取食水。

本研究由陆军总医院动物管理和使用委员会批准，并严格按照国际实验动物福利和动物伦理学要求进行实验。

1.2 实验仪器和试剂

冰冻切片机：德国LEⅠCA公司。荧光显微镜：日本奥林巴斯公司。兔抗BDNF抗体(批号ab108319)、兔抗TrkB抗体(批号ab187041)、兔抗Neun抗体(批号ab177487)、兔抗Ki67抗体(批号ab15580)：英国ABCAM公司。小鼠抗双皮质素(doublecortin,DCX)抗体(批号SC-271390)：美国SANTA CRUZ公司。高尔基染色液(批号G1069)、兔抗GAPDH抗体(批号GB11002)：武汉赛维尔生物科技有限公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ⅠgG二抗(批号M21002)：艾比玛特生物医药(上海)有限公司。Alexa Fluor488标记的山羊抗兔ⅠgG二抗(批号A0423)、Alexa Fluor555标记的驴抗小鼠ⅠgG二抗(批号A0460)：上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分组

采用双侧颈动脉结扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制备大鼠CSⅤD模型[16]。实验大鼠编号，随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和游泳组，每组16只。大鼠适应性饲养1周后，模型组和游泳组以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。大鼠仰卧位，颈正中切口约2 cm，仔细分离左侧颈总动脉，避免损伤神经肌肉，手术缝线结扎，关闭切口。待大鼠苏醒后回笼饲养。1周后相同方法结扎右侧颈总动脉。

术后4周，行挖穴试验评定，如与假手术组相比挖穴能力有显著性差异，提示造模成功。

假手术组大鼠仅分离双侧颈动脉，不结扎。

1.3.2 训练方案

游泳组大鼠于造模成功后游泳训练4周。游泳池为圆形罐，直径80 cm，高90 cm，水深60 cm，水温32～35℃。采用低强度游泳训练[17-18]，每天游泳时间共2 h，分两次，之间休息15 min。第1周训练3 d，以后每周增加1 d，共4周。

1.3.3 挖穴试验

BCCAO术后4周行挖穴试验，评定造模是否成功；并在每周游泳后行挖穴试验。塑料水管直径10 cm，长32 cm，填充沙砾2500 g。管的一端抬离地面6 cm。固定于16:00开始测试，2 h后称量管内剩余的沙砾质量作为基线，剩余沙砾用于挖穴能力测定。次日8:00再次称量剩余沙砾质量。评定标准参照Deacon[19]的研究。

1.3.4 Western blotting

挖穴试验测试完毕后，每组取5只大鼠，断头取脑，冰上快速分离海马组织，称取50 mg，加入含PMSF的PⅠPA裂解液(1∶500)300 ml中匀浆，4℃、12,000 r/min离心5 min，取上清；加4×蛋白上样缓冲液，BCA试剂盒测定蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，转膜；10%脱脂奶粉封闭2 h，分别加兔抗BDNF一抗(1∶1000)和兔抗TrkB一抗(1∶5000)，4℃过夜。TBST洗涤3次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶6000)室温2 h，TBST洗涤3次；以GAPDH(1∶2000)为内参。辣根过氧化物酶显影，Ⅰmage J软件分析灰度值，以与GAPDH灰度的比值作为蛋白相对表达量。

1.3.5 免疫荧光染色

每组5只大鼠10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔，剪开右心耳，从左心室灌注4℃生理盐水约250 ml，待右心耳流出清亮液体时，换4%多聚甲醛PBS溶液(pH=7.4)灌注约250 ml后取脑组织，海马区冰冻切片。高温抗原修复，常规画圈，滴加打孔液15 min；10%山羊血清封闭1 h，加兔抗Ki67一抗(1∶100)、小鼠抗 DCX(1∶50)和兔抗 Neun一抗(1∶300)，4℃过夜；PBS冲洗3次，滴加Alexa Fluor488标记的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶500)和Alexa Fluor555标记的驴抗小鼠ⅠgG二抗(1∶500)，室温2 h，PBS冲洗3次，DAPⅠ复染15 min，10%甘油封片。每只各取1张切片荧光显微镜下观察，Adobe Photoshop CS6软件中行阳性细胞计数。

1.3.6 高尔基染色实验

每组6只大鼠断头取脑，脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定1 d；换高尔基染液，2 d后换新，以后每3天换新，共14 d；15%糖水脱水1 d，30%糖水脱水2 d；蒸馏水洗1 min，浓氨水处理45 min，蒸馏水洗1 min，酸性坚膜定影液处理45 min，蒸馏水洗1 min；30%糖水4℃脱水3 d；海马区冰冻切片，厚20 μm，光镜下观察海马树突发育情况。选取树突长度相同的海马神经元，用Ⅰmage J 1.52a软件计算树突棘数量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学处理。所有数据均用(xˉ±s)表示。采用单因素方差分析，行方差齐性检验，若方差齐，行LSD-t检验，若不齐行Games-Howell检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 挖穴试验

训练前，模型组和游泳组较假手术组挖穴能力下降(P＜0.05)。随着游泳次数增加，游泳组剩余沙粒数减少，第3周和第4周，游泳组挖穴能力优于模型组(P ＜0.05)。见表1。

2.2 BDNF和TrkB蛋白表达

模型组和游泳组海马BDNF、TrkB蛋白表达均较假手术组下降(P＜0.05)，游泳组高于模型组(P＜0.05)。见图1、表2。

2.3 Ki67/DCX和Neun表达

模型组和游泳组Ki67、DCX和Neun阳性细胞率均低于假手术组(P＜0.05)，游泳组高于模型组(P＜0.05)。见表3、图2、图3。

表1 大鼠挖穴试验剩余沙粒质量(g)

图1 大鼠海马区Western blotting结果

2.4 树突复杂性

模型组和游泳组神经细胞树突棘数量均低于假手术组(P＜0.05)，游泳组高于模型组(P＜0.05)。见表4、图4。

表2 各组海马BDNF、TrkB蛋白表达比较(灰度比)

图2 大鼠海马齿状回Ki67和DCX表达(免疫荧光染色,×200)

图3 大鼠海马齿状回Neun表达(免疫荧光染色,×200)

图4 大鼠海马区域树突(高尔基染色，×400)

表3 各组海马Ki67、DCX和Neun阳性细胞率比较

表4 各组海马神经细胞树突棘数量比较(n)

3 讨论

细胞核增殖相关抗原ki67是检测细胞增殖的常用指标[20]，DCX是在迁移和分化的神经元上表达的一种微管相关蛋白，主要参与神经元前体细胞的增殖[21]，二者含量增加代表神经细胞增殖再生能力增强。运动可增加神经细胞分化增殖和树突的复杂性(包括长度和密度)[22]，树突及树突棘的数量越多，接受神经元刺激的面积越大，越容易传导细胞冲动。

本研究显示，有氧运动可促进海马神经增殖分化，增加Ki67、DCX的表达。长期(6～12个月)有氧运动增加前额叶皮层白质和灰质体积，以及胼胝体连接性[23]，促进前额叶皮质在认知损害中的康复[24]，中小强度的有氧加力量的混合运动也能够促进老年大鼠的海马神经发生[25]。我们推测，有氧运动可以使海马神经增殖再生，并改善CSⅤD患者认知障碍中海马相关的执行功能。

运动诱发的认知收益可能是多种机制综合作用的结果。Etnier等[26]认为，心血管健康可能是级联机制的一个组成部分，首先有氧运动可以改善心血管健康，这可能因为有氧运动增加血管壁的机械剪应力，上调基质细胞衍生因子-1增加脑血管新生[27]，促进脑血液循环和脑氧合增加，增加血脑屏障通透性，更有效地传递神经营养因子[28]。运动会激活海马N-甲基-D-天冬氨酸受体，促进BDNF表达和神经发生[29]，其机制可能在成熟的海马齿状回颗粒神经元中产生。颗粒神经元增加BDNF的产生，可以激活部分神经细胞上TrkB，通过触发cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)依赖性转录，诱导它们募集到细胞周期中，增加CREB的磷酸化，并刺激神经元类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor gene,ⅠGF-1)的摄取；随着更有效的血流递送，升高的ⅠGF-1可到达更多神经元，进一步增加CREB介导的BDNF表达[30]。CREB和BDNF在反复运动后上升，可促进神经发生，海马区神经可塑性也随之增加，引发功能改善，如执行功能和记忆改善[31]。

孙竹梅等[32]发现，有氧运动预处理可促进脑缺血再灌注后神经细胞存活和轴突再生；Lin等[33]发现，学习和记忆任务的表现随身体锻炼而改善；Thacker等[34]也发现，执行功能通过有氧运动得到改善；Li等[35]的临床试验显示，阻力训练有助于改善老年人的执行功能和整体认知功能。以上研究均与本研究结果相似。

对于某些认知领域，如执行和记忆，神经保护对认知的客观改善，要到老年认知衰退期才变得明显，因为这是大脑发生重大结构变化的时候[36]。有氧运动有助于缓解与年龄相关的认知衰退，尤其是与脑血管功能障碍，如CSⅤD相关的认知障碍。