苦参碱对白血病细胞K562诱导凋亡作用的研究

薛钰婷 冷波（通讯作者）

（1西南医科大学附属医院重症医学科 四川 泸州 646000）

（2西南医科大学附属中医医院普外科 四川 泸州 646000）

急性髓细胞白血病(AML)是造血干细胞恶性克隆性疾病。使白血病细胞凋亡，是治疗白血病的重要治疗方法。苦参碱(Matrine，MA)是传统中药苦参(Sophora flavescens Ait)的主要成分。研究显示[1]阿霉素使用在诱导MCF-7细胞凋亡中加入苦参碱可增加其诱导作用。研究报道[2]顺铂类药物在联合苦参碱药物使用时，可增强诱导SH-SY5Y的凋亡的作用，从而提高化疗的敏感性[3]。

本研究采用苦参碱药物作为影响因子，白血病细胞K562为研究对象，探索不同浓度苦参碱（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562细胞，检测凋亡相关因子caspase-3活性，探索随苦参碱药物浓度的增加，对白血病K562诱导凋亡的作用，并应用统计学分析差异。为苦参碱今后应用于白血病化疗提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 人白血病细胞株K562

1.1.2 主要实验试剂 苦参碱(纯度＞0.98，相对分子质量248.36)，胎牛血清，RPMI1640培养基，caspase-3检测试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 药物配制 苦参碱呈粉末状，需配制浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml使其终浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml备用。

1.2.2 细胞培养 将冻存冰箱的K562细胞取出，置于37℃水浴箱溶解，离心1000r/5min，去除上清液，用已经配制好的培养基培养。复苏后的细胞用培养瓶装载，置于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱培养，每2～3天换液传代。

1.2.3 实验分组 用苦参碱以下的浓度（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562为实验组，空白组只需加培养基作为对照，阴性组加0.01%DMSO为对照。

1.3 检测指标及方法

凋亡相关因子caspase-3活性的检测

操作步骤：

1.3.1 取对数生长期细胞，将细胞浓度调整为2×106/ml加入六孔板，设计六个实验组，空白组设置一个，其余五个为实验组，每组重复四孔。在六孔板里的每个孔加细胞悬液2ml，第一孔加2ml培养基为阴性组，其余四孔分别加入苦参碱，其终浓度分别是0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml各2ml为实验组。

1.3.2 置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养72h。

1.3.3 收集对照样品（即没有诱导凋亡的）和样品组（即诱导凋亡的），离心1000r/5min，去掉清液，PBS洗涤一次。

1.3.4 同前吸尽上清，按每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。

1.3.5 离心3000r/10min，把上请转移到96孔板。

1.3.6 caspase-3活性检测：按试剂盒说明操作。

1.4 统计学处理

运用SPSS17.0统计软件对数据统计学处理。计量资料用均值±标准差（±s）表示，各组应用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

实验结果：不同浓度的苦参碱0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml作用于白血病K562均能升高caspase-3活性，caspase-3活性呈升高趋势其受苦参碱浓度增加的影响，呈剂量依赖性。实验组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表。

表 不同浓度苦参碱作用K562升高caspase-3活性的作用（72h）

3.讨论

急性髓细胞白血病是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的克隆性恶性疾病。利用我国传统中医优势，从中药中寻找经济、有效、毒副作用小的抗白血病药物，在医学研究具有前景。如研究证实[4-5]植物多糖通过阻止凋亡蛋白激活信号通路，诱导白血病细胞K562分化，使用苦参碱后从而抑制肿瘤细胞生长[6]。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，caspase的全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，能够导致程序性细胞死亡。caspase-3活性检测试剂盒（caspase-3 Aspartate Protease）是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中的caspase-3酶活性的试剂盒。本试剂盒基于caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA而产生黄色的pNA，通过测定吸光度来检测caspase-3活性。

本研究内容为使用不同浓度的苦参碱药物为影响因子，作用于白血病K562细胞，按说明书的操作方法检测caspase-3，结果可见：苦参碱均能激活caspase-3（不同的浓度），其作用活性随着苦参碱的浓度增加而呈现增强趋势，并用统计学分析处理后显示结果具有统计学意义。

综上所述，苦参碱作用于白血病K562细胞能够升高caspase-3活性，通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡。从探索中发现，苦参碱药物有希望成为临床上辅助治疗白血病的一种有效、安全、实用的新药物。