HPLC法同时测定复方金银花颗粒中10种成分的含量

何 悦，王四旺，肖会敏,3

(1.陕西康城药业股份有限公司,陕西 商洛726000；2.空军军医大学中药和天然药物学教研室，陕西 西安 710032；3.陕西含光生物科技有限公司，陕西 西安 710032)

复方金银花颗粒由金银花、黄芩、连翘三味中药组成，具有清热解毒，凉血消肿之功效，用于风热感冒、咽炎、扁桃体炎、目痛、牙痛及痈肿疮疖等。方中金银花主要活性成分含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等作用[1-7]。连翘所含有效成分连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷等，具有抗菌、抗病毒等作用[8-11]。黄芩主要有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等，具有抗肿瘤、神经保护、心血管保护、降血糖等作用[12-21]。本处方由水提及醇沉等工艺制成。为分析该方中的功效成分，经文献检索未发现采用HPLC法同时测定制剂中10个成分即新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的研究报道，现报告如下。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪(型号Prominence UFLC，配有SPD-M20A二极管阵列检测器，LC/Labsoluion色谱工作站，日本岛津公司)；十万分之一电子分析天平(型号MS105DU，梅特勒公司)；KQ-100DA台式数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。乙腈、甲醇(色谱级，美国Fisher公司)；水为自制超纯水；其余为分析纯。绿原酸(批号：110753-201716，纯度99.3%)、咖啡酸(批号：110885-201703，纯度99.7%)、连翘酯苷A(批号：111810-201606，纯度93.4%)、连翘酯苷B(批号：111811-201603，纯度96.6%)、黄芩苷(批号：110715-201720，纯度93.5%)、汉黄芩苷(批号：112002-201702，纯度98.5%)、黄芩素(批号：111595-201306，纯度97.8%)等对照品均购自中国药品生物制品检定研究院；新绿原酸(批号：MUST-10091501，纯度98.0%)、隐绿原酸(纯度98.0%)、汉黄芩素(批号：B20489，纯度98.0%)等购自上海源叶生物科技有限公司；复方金银花颗粒(规格：10 g×10 袋/盒，批号：1804503～1804512，哈药集团世一堂制药厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～18 min， 5% A→20%A；18～42 min， 20% A→35%A；42～75 min， 35% A→50%A；75～90 min， 50% A →100 %A。记录时间为90 min。体积流量：0.8 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：320 nm；进样量：10 μl。

2.2 混合对照品溶液的配制

分别精密称取新绿原酸6.94 mg、绿原酸4.83 mg、隐绿原酸4.16 mg、咖啡酸10.03 mg、连翘酯苷B 13.91 mg、连翘酯苷A 17.98 mg、黄芩苷10.42 mg、汉黄芩苷7.12 mg、黄芩素4.99 mg、汉黄芩素5.18 mg置于20 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照溶液，作为储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品3袋内容物，研细，混匀，取10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 ml 溶解，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用50%的甲醇补足其减失的重量，摇匀，0.22 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液。

2.4 线性关系的考察

分别精密量取混合对照溶液0.06、0.08、0.10、0.20、0.40 ml和2.00 ml置于各个2 ml量瓶中，分别加甲醇定容，混匀，即得系列混合对照溶液1、2、3、4、5、6。用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样。以各对照品的浓度(μg/ml)为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归。线性方程、线性范围及相关系数r2见表1。结果表明，10种对照品在相应浓度范围内线性关系良好。

表1 对照品的线性方程、浓度范围及相关系数

2.5 专属性试验

分别精密量取混合对照溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl进样，分别记录色谱图。实验结果见图1，结果表明阴性对照无干扰，方法专属性强。

图1 混合对照品、供试品、阴性对照HPLC图 A.混合对照品；B.复方金银花颗粒；C.金银花阴性对照；D.连翘阴性对照；E.黄芩阴性对照1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.咖啡酸；5.连翘酯苷A；6.连翘酯苷B；7.黄芩苷；8.汉黄芩苷；9.黄芩素；10.汉黄芩素

2.6 精密度试验

精密吸取上述混合对照溶液5，重复进样5次，结果测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、连翘酯苷B、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.07%、1.01%、1.02%、1.07%、0.99%、0.72%、0.85%、1.02%、0.91%和0.85%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取上述混合对照溶液5，在第0、2、4、8、12、24 h进样。结果表明，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积的RSD分别为1.12%、1.00%、1.17%、1.02%、1.34%、1.24%、1.19%、1.15%、1.15%和1.35%，表明该溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品(批号：1804503)6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品，按“2.1”项下条件测定。测得平均含量与RSD值结果见表2，表明该方法重复性良好。

表2 复方金银花颗粒中10种成分含量重复性试验(mg/g)

2.9 加样回收率试验

取本品(批号：1804503)3袋内容物，研细，混匀，取10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，添加混合对照品溶液(称取对照品适量，配成每1 ml甲醇中含新绿原酸0.570 mg、绿原酸1.151 mg、隐绿原酸1.075 mg、咖啡酸0.085 mg、连翘酯苷B 0.467 mg、连翘酯苷A 0.740 mg、黄芩苷1.960 mg、汉黄芩苷0.350 mg、黄芩素0.250 mg、汉黄芩素0.260 mg的混合对照品溶液)8 ml、10 ml或12 ml，再按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，重复制样6份，结果见表3，表明该方法回收率良好。

表3 复方金银花颗粒加样回收率试验(n=6)

(续表3)

2.10含量测定

精密称取10批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品，按“2.1”项下条件测定。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、翘酯苷B、连翘酯苷A、连黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均含量(mg/g，10 g/袋)见表4。

表4 复方金银花颗粒中10种成分含量测定结果(mg/g)

3 分析与讨论

3.1 波长的选择

使用二极管陈列检测器对复方金银花颗粒样品进行全波长扫描，主要依据每个化合物的最大吸光值与分离度，确定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、连翘酯苷B、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的共同检测波长为320 nm。

3.2 色谱条件的选择

采用梯度洗脱，曾选择不同品牌的反相C18色谱柱，如Intersil C18、Kromasil C18、Ultimate®XB C18等进行比较，选择不同规格如(150 mm ×4.6 mm,5 μm)、(250 mm×4.6 mm,5 μm)等进行比较，选择不同流动相系统如乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液等，结果采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)与流动相系统乙腈-0.1%磷酸水溶液，结果分离度较好，故将此条件作为检测色谱条件。

3.3 供试品制备方法

参照文献[22]，同时对供试品的制备方法进行考察，如溶剂选择(甲醇、水、不同浓度的甲醇)、提取方法(超声及超声时间、加热回流)等，由于加热回流提取与超声提取比较，未见更多色谱峰信息，而超声提取时间短且色谱信息丰富。综合上述各因素，选择50%甲醇超声30 min提取，得到较理想的色谱峰信息(如峰面积大、分离度好等)。

3.4 成分含量

10批制剂中10种成分含量差异较小，说明各种成分均一性较好，生产工艺流程相对稳定。但本试验未进行不同厂家制剂含量的比较，将在以后试验中比较并进一步探讨入血成分及组织分布。

综上所述，本试验建立了复方金银花颗粒的10种成分HPLC含量测定方法，该方法操作简单、易于实施，准确、稳定、重复性好，同时为规范和优化本品的生产工艺，保证质量的均一性和稳定性，达到用药安全、稳定的目的提供了理论依据，因此该方法可作为评价复方金银花颗粒质量的有效方法之一。