不同水煮时间对黑胡椒粉水煮液中风味物质的影响研究

,,*,,

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁 571533; 2.国家重要热带作物工程技术研究中心,海南万宁 571533; 3.农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室,海南万宁 571533; 4.海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心,海南万宁 571533)

胡椒(PipernigrumL.)为胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物,是世界上重要的调味香料。在所有香料中胡椒的种植规模、产量和价值等都居于首位,被称为“香料之王”和“乌(黑)金”[1]。世界上胡椒主要分布在南美洲的中部和北部,主产国是印度、印度尼西亚、越南等,我国胡椒种植面积和产量分别居世界第6位和第5位。海南省是我国胡椒主产区,种植面积和产量均占全国的90%以上,种植面积约33万亩,产量约3.8万吨,年均产值20多亿元[2]。

胡椒常用于肉类食品的烹调[3],具有改善风味、增进食欲等功效,这与其风味活性成分密切相关。国内外关于胡椒风味成分的研究报道相对较多,胡椒碱是胡椒中的重要活性成分,不仅赋予胡椒强烈的辛辣味,而且具有抗炎镇痛、抗抑郁、抗肿瘤、促进药物代谢等作用[4-6]。胡椒精油亦被称为挥发油,是胡椒香气的主要物质来源[7],可采用水蒸汽蒸馏[10]、固相微萃取[9]、超临界流体等技术萃取[10-11],主要由89%萜烃、含氧萜烯及芳香化合物组成[9],具有抗氧化活性[12]。根据胡椒精油萃取方法和检测仪器的不同,检测到的风味化合物亦有所不同,Cardeal等[13]采用全二维气相色谱-质谱联用仪检测到胡椒中存在273种挥发性化合物。这些化合物的组成及含量会受到所用胡椒产区、品种以及原料成熟度、前处理方式以及制备工艺等的影响而不同[14-17]。胡椒风味物质在日常煮制过程中容易挥发,但其对于煮制液中胡椒风味的影响及变化规律尚未见研究报道。

本实验以黑胡椒为主要原料,采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技术,研究黑胡椒粉风味物质在水煮过程中的变化,以期为调控胡椒风味、胡椒挥发油的提取以及胡椒调味产品的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑胡椒粒 由海南兴科热带作物工程技术有限公司提供;95%乙醇(分析纯) 西陇化工股份有限公司;甲醇(色谱纯) 默克股份两合公司(德国);胡椒碱(色谱纯,纯度>98.00%) 北京世纪奥科生物技术有限公司。

Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 上海安谱实验科技股份有限公司;SPME 手动进样手柄 美国安捷伦科技有限公司;HW·SY11 型电热恒温水浴锅 常州恒隆仪器有限公司;QE-300 g高速万能粉碎机 浙江屹立工贸有限公司;Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;HDM-100电热套 常州国华电器有限公司;AL104电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 用粉碎机粉碎黑胡椒粒,粉末过筛,收集60～80目筛中间的粉末,准确称取10.00 g黑胡椒粉于1000 mL圆底烧瓶中,加入500 mL去离子水,烧瓶口接挥发油接收器和冷凝管,电热套加热,水溶液沸腾后开始计时(10、30、60、90、120、180、240 min),收集挥发油后,将圆底烧瓶取出冷却至室温后,将水煮液于4000 r/min下离心5 min,收集上清液,待测水煮液中的风味物质。

1.2.2 胡椒碱含量测定 用高效液相色谱仪检测上清液中的胡椒碱含量,仪器检测条件参考国家标准(GB 17582-2009),即以甲醇和水为流动相,体积比为77∶23,流速为1.0 mL/min,检测波长为343 nm,进样量10 μL,外标法定量。即准确称取胡椒碱标准品0.0013 g,加入95%乙醇溶解后定容至10 mL棕色容量瓶中,取1.0 mL该溶液配制25 mL工作液,并用工作液配制不同浓度的标准溶液,过0.45 μm膜,高效液相色谱仪检测。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制胡椒碱标准曲线,通过线性拟合得到回归方程:y=115.51x-47.69,相关系数为0.9973。

1.2.3 胡椒挥发油含量测定 参考国家标准GB/T 17527-2009《胡椒精油含量测定》的方法测定,以实验设计1.2.1收集的黑胡椒粉为主要原料,利用水蒸汽蒸馏出挥发油,根据所得挥发油体积,计算单位质量胡椒样品所含挥发油含量,重复3次测定。

1.2.4 胡椒水煮液中挥发性风味物质的HS-SPME-GC-MS分析 参考Henryk等[9]的方法略有修改,以DVB/CAR/PDMS纤维头为萃取头,在250 ℃老化后,准确称取3.00 g实验设计1.2.1收集的上清液于15 mL固相微萃取瓶中,50 ℃水浴平衡15 min后插入老化好的萃取头顶空萃取15 min,然后在进样口250 ℃解吸8 min,进行GC-MS分析测定。

GC-MS分析条件:色谱柱型号:BR-5 MS(30 m×0. 25 mm,0.25 μm)。升温程序:起始温度为40 ℃,保持5 min,然后以3 ℃/min升到45 ℃,保持3 min,然后以4 ℃/min升到100 ℃保持2 min,以5 ℃/min升到230 ℃,保持5 min;载气(He)流速1. 0 mL/min,进样量1 μL,不分流。离子源为EI源,温度为230 ℃,接口温度150 ℃,全扫描:m/z 35～550。

通过NIST14谱库检索数据,采用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分比含量。

1.3 数据分析

所得数据用Excel和SPSS 17.0分析,色谱图用Origin 8.5绘制。

2 结果与分析

2.1 水煮时间对水溶液中胡椒碱含量的影响

胡椒碱标准品和水煮液的HPLC图谱见图1。

图1 胡椒碱标准品(A)和胡椒水煮液(B)的高效液相图谱Fig.1 HPLC chromatograms of piperine standard(A) and the solution of boiled black pepper(B)

由图1可知,在同一检测条件下,与胡椒碱标准品的高效液相图谱比对,发现胡椒碱标准品的保留时间和胡椒煮制液中的保留时间一致,确定胡椒煮制液中含有胡椒碱,这说明胡椒煮制过程中,胡椒粉中的胡椒碱逐渐被溶解在水煮液中。

从图2可以看出,随着煮制时间的延长,水煮液中胡椒碱含量呈现逐渐增加的趋势,煮制90 min时,水煮液中的胡椒碱含量最高,然后逐渐趋于平缓,煮制时间过久,胡椒碱含量会缓慢降低,这与Nisha等[4]研究报道的一致,胡椒碱在加热的情况下含量会随着时间的延长而减少,这可能与胡椒碱的热不稳定性有关。以上说明,适宜的水煮时间可加速胡椒粉中的胡椒碱的溶出,选择水煮时间90 min为宜。

图2 不同时间下水煮液中胡椒碱的含量Fig.2 Contents of piperine in the solution of boiled black pepper at different time

2.2 水煮时间对胡椒挥发油含量的影响

在煮制过程中,通过烧瓶上接挥发油收集器和冷凝管收集挥发油,发现胡椒粉在水溶液中沸腾后,挥发油在开始阶段迅速被蒸发出来,随着时间延长,含量缓慢增加,见图3。水煮30 min时,其挥发油含量达到1.105 mL/100 g,与10 min时无显著性差异(p>0.05),水煮60、90 min,其挥发油含量分别增加到1.328、1.366 mL/100 g,而水煮120 min,其挥发油含量达到1.66 mL/100 g,与水煮180、240 min无显著性差异(p>0.05),其挥发油含量均为1.66 mL/100 g。根据国家标准《GB/T 17527-2009 胡椒精油含量的测定》,胡椒粉挥发油测定需要蒸馏提取4 h,以提取4 h所得的胡椒精油含量为胡椒粉中精油的总含量,通过计算发现,胡椒粉水煮10 min,其66.60%的挥发油即可被蒸馏出来,水煮60 min,胡椒粉中80%的挥发油可被蒸馏出来,水煮120 min,挥发油含量趋于最大,之后基本保持不变。由此推断,胡椒粉中的挥发油容易被蒸馏出来,在水煮过程中水煮时间不宜超过120 min。但水煮时间是否影响水煮液中风味物质的组成不得而知,因此,特对胡椒水煮液进行HS-SPME-GC-MS分析。

图3 不同水煮时间对挥发油含量的影响Fig.3 Effect of different boiling time on the content of volatile oil 注:不同小写字母表示在0.05水平上差异显著(p<0.05);图5同。

2.3 水煮时间对水煮液中风味物质组成的影响

不同水煮时间下水煮液中风味物质的总离子流图见图4。从图4可以看出,不同水煮时间下胡椒水煮液中的风味化合物数量存在显著性差异(p<0.05)。

图4 不同水煮时间下胡椒水煮液中风味物质的总离子流图Fig.4 Total ion current chromatograms of flavor components in the solution of boiled black pepper at different time

不同水煮时间下水煮液中风味物质的总峰面积如图5所示。从图5可以看出,随着煮制时间的延长,水煮液中风味物质的总峰面积在不断减少,煮制10 min风味物质总峰面积最高,其次是煮制30 min,煮制240 min风味物质总峰面积最低。这与胡椒中挥发性风味物质的挥发性有关,浸没于水中的胡椒粉随着水煮时间的延长,其中的挥发性风味物质逐渐与水蒸汽共馏出来,因此检测到的水煮液中挥发性风味物质总量在减少,这与本实验结果与分析2.2中胡椒粉挥发油含量结果一致,随着水煮时间的延长,通过挥发油收集器收集到的挥发油含量在逐渐增加。Nisha等[4]研究了不同烹饪过程中黑胡椒粉中胡椒碱和胡椒油树脂的降解动力学,发现黑胡椒粉中胡椒碱和胡椒油树脂的含量随着烹饪温度的增加和烹饪时间的延长而逐渐减少,在相同烹饪时间下,温度越高,胡椒碱和胡椒油树脂含量减少的程度越大。以上表明,黑胡椒粉中的挥发性风味物质在水煮条件下容易挥发,胡椒煮制时间不宜过长。

图5 不同水煮时间下风味物质的总峰面积Fig.5 Total peak area of flavor components in the solution of boiled black pepper at different cooking time

在不同水煮时间下胡椒水煮液中风味物质的相对百分比含量见表1。

表1 不同水煮时间下胡椒水煮液中风味物质的相对含量Table 1 Relative content of flavor components in the solution of boiled black pepper at different boiling time

续表

从表1中可以看出,黑胡椒粉在不同水煮时间下,随着水煮时间的增加,水煮液中可检测出的风味物质数量在逐渐减少,分别为65、63、44、50、32、30、32种化合物。从化合物种类来看,胡椒水煮液中的挥发性风味物质主要为单萜类化合物、倍半萜类和少量的芳香化合物。在水煮过程中,各种类化合物相对含量均存在较大变化。其中,相对含量较高的风味物质是石竹烯(55.75%,60 min)、3-蒈烯(19.95%,10 min)、柠檬烯(15.00%,10 min)、δ-榄香烯(13.35%,60 min)、胡椒烯(9.38%,180 min)。Jirovetz等[7]、Martins等[8]、Henryk等[9]等指出胡椒特征风味主要来源于胡椒精油中的石竹烯、柠檬烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-水芹烯、α-律草烯、胡椒烯、榄香烯等化合物,Jagella等[18]采用浓度稀释法鉴定出马来西亚黑胡椒中的特征风味物质是芳樟醇、α-水芹烯、柠檬烯、月桂烯、α-蒎烯、3-甲基丁醛和甲基丙醛。由于本实验仅对胡椒水煮液进行分析,α-水芹烯、3-甲基丁醛和甲基丙醛等化合物未检出,芳樟醇相对含量较低,最高不超过0.81%,考虑到胡椒品种和生产区域差异,特选择水煮液中相对含量较高的特征风味成分β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、柠檬烯、δ-榄香烯、胡椒烯、石竹烯和律草烯8种风味化合物作图6,以明确比较海南省黑胡椒风味物质在不同水煮时间下的变化规律。

图6 不同水煮时间下胡椒水煮液中主要风味物质的相对含量Fig.6 Relative content of main flavor components in the solution of boiled black pepper at different boiling time注:1:β-蒎烯;2:月桂烯;3:3-蒈烯;4:柠檬烯;5:δ-榄香烯;6:胡椒烯;7:石竹烯;8:律草烯。

图6中β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、柠檬烯等化合物属于单萜烯类化合物,δ-榄香烯、胡椒烯、石竹烯和律草烯等化合物为倍半萜烯类化合物。从图6可以看出,单萜烯类化合物随着水煮时间的延长呈现缓慢减少后缓慢增加的趋势,在60 min时相对含量最低,而倍半萜烯类化合物随着水煮时间的延长呈现先增加后缓慢减少,在水煮60 min时相对含量达到最高。石竹烯是胡椒水煮液中相对含量最高的倍半萜类化合物,水煮10 min即可迅速增加至26.22%,水煮60 min时相对含量最高,达到55.75%,然后缓慢降低至46.63%。3-蒈烯是胡椒水煮液中含量次高的单萜烯类化合物,在水煮过程中,随着水煮时间的增加,其相对含量由水煮10 min的19.95%降低至30 min的15.11%,在水煮60 min时最低,之后又缓慢增加至8.08%。这些风味化合物在水煮过程中呈现的规律性变化,与各化合物的性质有关,由于倍半萜烯类化合物沸点相对单萜类化合物较高,在同一水煮条件下,挥发程度不一样,且在水煮时外接冷凝装置和挥发油收集器,在水煮过程中逐渐被蒸馏出来,这些风味物质多是挥发性的香味物质,虽然大多数不溶于水,但胡椒中存在淀粉、蛋白质等多种成分,在水煮过程中,风味物质可能与其他成分存在吸附或相互作用而发生含量变化,致使水煮液呈现不同的风味。如β-蒎烯具有特有的松节油香气,月桂烯亦称为香叶烯,具有令人愉快的香气,3-蒈烯具有松木样香气,柠檬烯具有柑橘、柠檬的香气,δ-榄香烯具有温和的木香气味,胡椒烯亦称为古巴烯,具有蒿草味;石竹烯和律草烯具有辛香、柑橘香、温和的丁香香气[18]。结合水煮液中胡椒碱含量变化规律,综合分析比较,黑胡椒粉水煮60 min内,水煮液呈现松木香味,水煮60 min后,胡椒水煮液呈现辛香味。

3 结论

本文采用HPLC和HS-SPME-GC-MS研究了黑胡椒粉在不同水煮时间下水煮液中风味物质的组成及含量变化,结果表明,胡椒中的主要辣味物质胡椒碱在水煮90 min时含量最高;水煮60 min黑胡椒粉中80%的挥发油可被蒸馏出来,水煮120 min挥发油含量趋于最大值;对黑胡椒水煮液进行HS-SPME-GC-MS分析,共鉴定出66种挥发性风味物质,单萜烯类化合物随着水煮时间的延长呈现缓慢减少后缓慢增加的趋势,在60 min时相对含量最低,而倍半萜烯类化合物随着水煮时间的延长呈现先增加后缓慢减少,在水煮60 min时相对含量达到最高,其中,石竹烯在水煮60 min时含量最高55.75%,而3-蒈烯(19.95%)、柠檬烯(15.00%)和β-蒎烯(4.72%)在水煮10 min时含量最高,δ-榄香烯(13.35%)在水煮60 min时含量最高;随着水煮时间的增加,胡椒水煮液中风味物质的数量逐渐减少,表明黑胡椒粉水煮时间不宜过长。这些风味化合物随着水煮时间的变化而发生组成及含量变化,赋予了胡椒水煮液不同的风味,黑胡椒粉水煮60 min内,水煮液整体呈现松木香味,水煮60 min后,胡椒水煮液整体呈现辛香味。