荸荠加工废弃物混合发酵法 制备水产益生菌的工艺优化

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(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300; 2.广东农工商职业技术学院,广东广州 510507; 3.广州质量监督检测研究院,广东广州 510000; 4.广州市洲星食品有限公司,广东广州 510000)

荸荠(Eleocharisdulcis)俗称马蹄,在中国种植面积约63万亩,年产量60～85万吨,其中以广东、广西地区种植较为集中。荸荠加工食品有荸荠粉、荸荠糕、荸荠露等。2016年荸荠工业加工食品产值已达872亿元,每年荸荠加工所产生的废渣、废水约300万吨,给生态环境带来了极大的压力[1-3]。但是,研究发现荸荠加工废弃物含有一定的淀粉、蛋白、糖、脂肪、膳食纤维等营养物质和抗菌活性物质[4-6],是一种较为理想的水产饲料来源。

在水产养殖中,抗生素和药物的人为滥用对环境安全与人类健康的消极影响已日益突显,水产养殖中有益微生物逐步替代抗生素和激素已成为趋势,这也将为人们提供更安全的绿色食品[7]。基于上述原因,本实验选择在动物体内具抑制胃肠道中致病菌繁殖、增强机体免疫能力的植物乳杆菌和能够帮助机体消化食物、合成较齐全氨基酸从而提高饲料生物效价的酿酒酵母作为发酵菌种[8-10]。以荸荠加工过程产生的大量废渣废水等废弃物为原料制备养殖用益生菌添加剂,解决荸荠加工过程产生废弃物对环境的污染,也为水产养殖提供水产益生菌减少养殖过程抗生素的使用产生重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)冻干粉 活菌量为400×109CFU/g,标记为BL191,为本实验室分离-40 ℃保存;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)冻干粉 活菌量为700×109CFU/g,标记为SC187,购自广州微生物研究所;荸荠粉生产工业废渣(由荸荠经水清洗、打碎,提取荸荠粉后所留下的荸荠渣)、荸荠粉生产工业废水(提取荸荠粉后所留下的槽沉废水) 均为广州洲星食品有限公司;氨基酸标品 北京普合生物技术有限公司。

Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MP511 Lab pH Meter 上海三信仪表厂;MOF-4086S低温冰箱 日本三洋公司;HH-6数显恒温培养箱 常州国华电器有限公司;A300氨基酸自动分析仪 德国曼默博尔;Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荸荠加工废弃物适宜微生物的筛选 取植物乳杆菌(BL191)、酿酒酵母(SC187)、植物乳杆菌(BL191)与酿酒酵母(SC187)的混合菌种分别加入灭菌0.75% NaCl溶液,混合均匀,制得1×108CFU/mL的菌种液。将菌种液按1∶10 (v/v)的比例分别接种到下列试验编号的样品中。1号瓶:800 mL荸荠废水,置1 L灭菌广口瓶中;2号瓶:400 g荸荠废渣,加400 mL无菌水,置1 L灭菌广口瓶中。接种后于(37±0.5) ℃发酵48 h,进行感官分析(1.2.2)和乳酸菌数和酵母计数,选择发酵微生物。

1.2.2 感官评价 由男、女各5名实验员,进行感官评价技术培训后按以下步骤进行感官评价。取出适量样品(约10～15 g),置于光线充足、无异味的白色滤纸上或玻璃器皿内,进行目测,观察其色泽、形态,用口尝其滋味、鼻闻其气味[11]。

1.2.3 乳酸菌数和酵母菌数测定方法 乳酸菌数和酵母菌数分别按GB4789.35-2016操作检测[12],GB4789.15-2016操作检测[13]。

1.2.4 单因素实验 由于荸荠加工过程,产生的废水量是废渣的2倍以上[14],所以考虑到合理利用荸荠加工废弃物,本文所有实验均以荸荠的废渣和废水1∶2 (V/V)混合物为发酵基料,以发酵后的活乳酸菌数和酵母菌数为指标,考察不同发酵条件对发酵液中活菌数的影响。

1.2.4.1 接种比例对发酵液中活菌数的影响 将BL191与SC187按1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1质量比混合后按8% (v/v)接种于废渣和废水混合物中[15],(37±0.5) ℃发酵48 h,每组实验重复3次,确定合适的混合菌种混合比例。

1.2.4.2 接种量对发酵液中活菌数的影响 将BL191∶SC187按3∶7比例混合,分别以不同的接种量(6%、8%、10%、12%、14%)接种于废渣和废水混合物中,(37±0.5) ℃发酵48 h后测试结果,每组实验重复3次,确定合适的混合菌种接种量。

1.2.4.3 发酵温度对发酵液中活菌数的影响 将BL191∶SC187按3∶7(1.2.4.2得出，g/g)混合,以混合菌种12%(v/v)接种量于废渣和废水混合物中,于不同的发酵温度下(26、30、34、37、42 ℃)分别发酵48 h后测试结果,每组实验重复3次,确定合适的混合菌种生长的温度。

1.2.4.4 发酵时间对发酵液中活菌数的影响 将BL191∶SC187按3∶7 (g/g)混合,以混合菌种12%(v/v)接种量于废渣和废水混合物中,37 ℃发酵。在不同发酵时间(24、36、48、60、72 h)后测试结果,每组实验重复3次,确定适合的发酵时间。

1.2.5 正交试验优化复合菌种发酵条件 以发酵后的活乳酸菌数和酵母菌数为指标进行4因素3水平的L9(34)正交试验,各因素及水平设计如表1所示,每组实验重复3次。

表1 荸荠加工废弃物微生物发酵正交实验因素水平Table 1 Factors of water chestnut processing waste microbial fermentation orthogonal experiment

1.2.6 荸荠加工废弃物营养成分分析 对荸荠加工废渣废水1∶2 (V/V)混合物发酵前后分别进行总糖、蛋白质、总酸(以乳酸计)、乳酸、脂肪、淀粉、粗纤维、膳食纤维等营养成分含量比较,测定方法如下:总糖:按GB 5009.8-2016方法检测[16];蛋白质:按GB 5009.5-2016方法检测[17];总酸(以乳酸计):按GB/T 12456-2008方法检测[18];乳酸:按SN/T 2007-2007方法检测[19];脂肪:按GB 5009.6-2016方法检测[20];淀粉:按GB 5009.9-2016方法检测[21];粗纤维:按GB/T 5009.10-2003方法检测[22];膳食纤维:按GB 5009.88-2014方法检测[23];氨基酸:按GB 5009.124-2016方法检测[24]。

1.3 数据处理

实验数据利用SPSS 20.0 软件,采用单因素方差分析进行显著性差异比较(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 发酵适宜微生物的筛选

如表2所示,单一菌种接种表明BL191和SC187均可以分别利用荸荠淀粉废水和荸荠渣中有机营养物质进行生长发酵并成为优势菌群。在荸荠渣中BL191和SC187分别可达到菌数最高14.1×108和9.0×108CFU/g。两种菌混合接种表明BL191和SC187可以在共生条件中利用荸荠淀粉废水和荸荠渣中有机营养物质进行生长发酵并成为优势混合菌群。在荸荠渣中BL191和SC187混合发酵分别可达可达到菌数最高13.5×108和8.1×108CFU/g。因此,以荸荠加工过程产生的大量废渣废水为原料利用两种益生菌BL191和SC187混合发酵法制备水产养殖，用益生菌添加剂是可行的。

表2 BL191和SC187在荸荠加工废弃物中的发酵菌落数Table 2 Microbial content of BL191 and SC187 in processing wastes of water chestnut

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 菌种最适混合比例 如表3,当植物乳杆菌、酿酒酵母混合比例为1∶9时酵母菌达到峰值17.1×108CFU/g,此时乳酸菌只有8.9×108CFU/g,可能是由于酵母菌过快生长产生的酒精抑制了乳酸菌生长;当植物乳杆菌、酿酒酵母比例为9∶1时乳酸菌数最高,达到39.1×108CFU/g,此时酵母菌只有3.1×108CFU/g,可能是由于乳酸菌过快生长产生的乳酸抑制了酵母菌生长。当植物乳杆菌、酿酒酵母比例为3∶7时,此时乳酸菌为28.2×108CFU/g,酵母菌为16.1×108CFU/g,混合菌活菌总数为44.3×108CFU/g,达到最高。因此选择植物乳杆菌、酿酒酵母比例为3∶7。

表3 两种菌不同接种比例的菌落数Table 3 Microbial content of inoculation ratio of two strains

2.2.2 最适接种量 如表4随着接种量的增大,发酵后植物乳杆菌、酿酒酵母活菌数都出现了上升趋势,直到接种量为12%时出现了拐点,此时乳酸菌活菌数最高,达到29.1×108CFU/g,酵母菌为16.3×108CFU/g,混合菌活菌总数为45.4×108CFU/g。当接种量为14%时植物乳杆菌、酿酒酵母活菌数并没有随着接种量的增多而上升,当发酵菌成为优势菌群后受接种量的影响变小。因此,选择混合菌种的接种量为12%。

表4 两种菌不同接种量的菌落数Table 4 Microbial content of inoculum size of two strains

2.2.3 最适发酵温度 两种益生菌具有各自适宜的生长温度条件[9,25],通过发酵温度选择单因素实验可以了解到在不同温度条件下它们的共同生长情况。结果如表5,乳酸菌在37 ℃为适宜生长温度,出现峰值为29.9×108CFU/g;酵母菌在34 ℃为适宜生长温度,出现峰值为18.9×108CFU/g。37 ℃时混合菌活菌总数出现峰值46.2×108CFU/g,因此37 ℃为适宜混合菌种生长温度。

表5 不同发酵温度的菌落数Table 5 Microbial content of different fermentation temperatures

2.2.4 最适发酵时间 两种益生菌具有各自增长速率[9,26],结果如表6。24 h内酵母菌快速增长,24 h后酵母活菌数基本保持稳定。而乳酸菌则是在发酵后24～48 h出现快速增长,48 h后乳酸菌总数开始下降。选择发酵48 h最佳,混合菌活菌总数出现峰值47.2×108CFU/g。

表6 不同发酵时间的菌落数Table 6 Microbial content of different fermentation times

2.3 培养条件优化结果

在单因素实验的基础上用正交实验优化工艺参数。表7表明,影响植物乳杆菌(BL191)发酵的主要因素依次为接种比例B、接种量A、温度D、时间C,最佳发酵条件是A3B2C2D3,即接种量12%、BL191与SC187比例为3∶7 (g/g)、发酵时间48 h和发酵温度37 ℃;影响酿酒酵母(SC187)发酵的主次因素依次为温度D、接种量A、接种比例B、时间C,最佳发酵条件是A3B2C2D2,即接种量12%、BL191与SC187比例为3∶7 (g/g)和发酵时间48 h、发酵温度34 ℃。

表7 正交实验优化培养条件结果Table 7 Experimental results of orthogonal experiment

如表8验证实验结果可知,在植物乳杆菌(BL191)最佳工艺条件A3B2C2D3,植物乳杆菌(BL191)菌数为39.9×108CFU/g,酿酒酵母(SC187)菌数为7.9×108CFU/g;在酿酒酵母(SC187)最佳条件A3B2C2D2,植物乳杆菌(BL191)菌数为33.9×108CFU/g,酿酒酵母(SC187)菌数为15.9×108CFU/g;正交实验中混合菌活菌总数最高组合为A3B2C1D3,植物乳杆菌(BL191)菌数为27.1×108CFU/g,酿酒酵母(SC187)菌数为11.2×108CFU/g。综合考虑两种微生物的在终产品微生物饲料添加剂的实际利用价值,选择A3B2C2D2为发酵条件,此时两种有益菌总和为49.8×108CFU/g,混合菌活菌总数RSD为0.07%。

表8 验证实验结果(n=3)Table 8 Results of verification experiment(n=3)

2.4 发酵前后营养成分分析

如表9,其中总糖、淀粉含量显著降低,乳酸、总酸升高,说明混合菌种利用废渣废水混合物的总糖、淀粉成分进行有机酸的转换,乳酸/总酸比值为97.7%,说明混合菌种在进行乳酸发酵。

表9 荸荠加工废弃物发酵前后营养成分含量分析Table 9 Nutrient content analysis of water chestnut wastes before and after fermentation

采用该工艺发酵荸荠加工后的废水和废渣制备的微生物饲料中产生大量乳酸,乳酸在生物体内可以使胃、肠中的pH降低,生物体中多为酸性消化酶[27],从而可以激发酶的活性作用[28]。

经混合菌发酵后荸荠废渣废水1∶2混合物结果如表10。氨基酸总量由4.4 g/100 g上升为7.9 g/100 g。18种氨基酸均出现了上升,8种必需氨基酸除亮氨酸外均增加了50%以上,亮氨酸增加48.3%。酿酒酵母(SC187)可以产生较齐全氨基酸,提高了水产微生物饲料的营养价值。

表10 荸荠废渣废水1∶2混合物发酵前后氨基酸成分含量分析Table 10 Amino acid content analysis of water chestnut waste mixture before and after fermentation

3 结论

采用BL191和SC187两种益生菌复合发酵荸荠加工废弃物,能制备出富含益生菌和氨基酸的发酵液。通过单因素实验和正交试验优化得到BL191和SC187复合发酵荸荠废渣废水制备微生物饲料的最佳工艺条件为荸荠渣、荸荠废水混合比例1∶2 (g/mL),BL191和SC187按3∶7 (g/g)比例混合,接种量12%,发酵温度34 ℃,发酵时间48 h,制备得到的微生物饲料中BL191菌数为33.9×108CFU/g,SC187菌数为15.9×108CFU/g;含有丰富的营养物质,其氨基酸总量较发酵前提高了1.8倍,亮氨酸增加了48.3%,其他7种必需氨基酸均提高了50%以上。

该工艺不仅为水产养殖提供一种很好的益生菌饲料添加剂,而且使荸荠加工后废水、废渣得到充分利用。益生菌可以提高养殖水产品的抗病性,因而可以减少抗生素的使用,针对目前养殖中滥用抗生素有着重要的意义。