苦瓜挥发油超临界二氧化碳 萃取工艺优化及其抗炎活性研究

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(1.国家中医药管理局亚健康干预技术实验室,湖南长沙 410128; 2.湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128; 3.湖南农业大学，湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室,湖南长沙 410128; 4.湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是葫芦科属植物,果实夏秋季节成熟,可做日常食用,鲜片晾干后具有清热解毒,祛暑明目的功效,可降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等[1]。世界各地种植广泛,具有较大的开发价值。苦瓜蛋白、多肽、多糖、皂苷、植物凝集素等在国内外研究较多[2-5],其活性成分主要有辅助抗氧化、辅助降血糖和降脂、免疫调节等作用。其中苦瓜调节炎症反应在诸多功能中扮演重要角色。炎症反应主要是由氧代谢增强、脂质体氧化、感染等激活,它能促使免疫细胞增殖、分化,对机体起到保护作用;然而过度的炎症反应会造成病理性的免疫疾病,危害机体的正常生理功能,造成动脉粥样硬化、胰岛素抵抗及其他自身免疫疾病,其中一氧化氮的表达会增强巨噬细胞炎症,促进粥样动脉硬化等疾病[6]。因此调节人体的炎症对维持人体健康有着重要所用。

研究表明苦瓜提取物在调节炎症方面具有良好的作用。何利惠等[7]发现:α-苦瓜素可显著加强小鼠巨噬细胞对肥大细胞的杀伤作用;陈彦光等[8]研究表明β-苦瓜素能够显著抑制小鼠脾细胞由脂多糖诱导而产生的促有丝分裂症状,延迟小鼠的过敏反应;张晓峰[9]研究表明苦瓜提取物可通过抑制NF-kB的信号通路,降低炎症因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α的释放。目前国内外对苦瓜挥发油的研究较少,随着挥发油萃取技术的发展,天然挥发油的抗炎作用逐渐被人们发现,其中鱼腥草素[10]、丹皮酚[11]、樟脑[12]等广泛应用于炎症引起的疾病。超临界CO2流体萃取技术近年来广泛应用,尤其适用于天然挥发油的开发,采用该方法具有无溶剂残留、萃取效率高、萃取温度低等优势,主要应用于医药、食品、化妆品等领域[13]。脂多糖能诱导小鼠巨噬细胞向经典的巨噬细胞M1型极化,分泌大量的炎症因子NO[14],常用于活性物质抗炎功能评价。

针对目前苦瓜挥发油研究现状及其提取物具有显著的抗炎活性的潜力,本文以苦瓜为原料,以挥发油得率为指标,利用Box-Behnke响应面法(RSM)研究影响超临界CO2萃取苦瓜挥发油的主要因素及其相互关系。评价了苦瓜挥发油对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞释放炎症因子NO的影响。为苦瓜挥发油的抗炎活性物质的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦瓜(苦瓜干饮片) 青春康健药材公司,产地为广西;正己烷 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;CO2纯度99.5%以上,长沙市特种气体厂;小鼠RAW 264.7巨噬细胞 中国科学院细胞库;一氧化氮试剂盒 南京建成生物工程研究所。

6850型色谱仪、5975C型质谱仪 含Agilent 化学工作站,美国Agilent公司;PL403电子天平 Mettler Toledo公司;ZN-400A型高速中药粉碎机 中南制药机械厂;HA231-50-06型超临界萃取设备 江苏南通华安超临界萃取有限公司;GENios酶标仪 瑞士Tecan;HERA CELL 150培养箱 美国Kecdro。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验 萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量以及物料颗粒影响萃取的得率,苦瓜质地疏松,易于CO2流体在物料内扩散所以流量和粉碎粒度对苦瓜挥发油得率影响较小,所以选择萃取压力、萃取温度、萃取时间为单因素实验条件。固定条件为500 g粉碎至20目苦瓜干粉，置于5 L萃取釜中，超临界CO2流量20 L/h,萃取温度45 ℃,萃取时间90 min,考察不同萃取压力(10、15、20、25、30 MPa)对苦瓜挥发油得率的影响;固定条件为500 g粉碎至20目苦瓜粉，置于5 L萃取釜中，超临界CO2流量20 L/h,萃取压力25 MPa,萃取时间90 min,考察不同萃取温度(35、40、45、50、55 ℃)对苦瓜挥发油得率的影响;固定条件为500 g粉碎至20目苦瓜粉，置于5 L萃取釜中，超临界CO2流量20 L/h,萃取温度25 MPa,萃取温度50 ℃,考察不同萃取时间(30、60、90、120 min)对苦瓜挥发油得率的影响。

挥发油得率(%)=萃取挥发油量/苦瓜干质量×100

1.2.2 响应面试验设计 根据单因素实验结果,采用Box-Behnken 3因素3水平的响应面(RSM)设计,考察萃取压力、萃取温度、萃取时间对苦瓜挥发油得率的影响,得出二次多项回归方程拟合并做优化分析。苦瓜挥发油萃取试验设计见表1。

表1 Box-Behnken实验因素水平编码表Table 1 Factors levels and codingTable of Box-Behnken design experiment

1.2.3 挥发油成分检测 采用GC-MS检测。将获得的苦瓜挥发油稀释10-3倍溶于正己烷,过0.45 μm膜;色谱柱为毛细管HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),初始柱温50 ℃,程序升温10 ℃/min升温至160 ℃,再以20 ℃/min升温至320 ℃。进样口温度280 ℃(99.999% He),流速1 mL/min,进样量1 μL;分流比10∶1,EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃;溶剂延迟3 min,质核比扫描范围(35～550 m/z)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 萃取压力对苦瓜挥发油得率的影响 如图1，压力能够影响超临界CO2密度,密度与挥发油的溶解度相关。在45 ℃时,随着萃取压力的增大挥发油得率显著增加,当增加到一定程度后,挥发油收率增速缓慢,且萃取压力过大,易产生沟流现象使原料板结。由图1可见当压力从10 MPa增大到25 MPa时苦瓜挥发油得率明显增加,当压力达到30 MPa后,苦瓜挥发油得率不再增加,考虑各方面因素后,选25 MPa为最佳萃取压力。

图1 萃取压力对苦瓜挥发油得率影响Fig.1 Influence of extraction pressure on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.1.2 萃取温度对苦瓜挥发油得率的影响 温度能够影响CO2在物料中的扩散速度。由图2可知，随着温度的升高,苦瓜挥发油得率随之升高,当温度高于50 ℃后,苦瓜挥发油得率下降,这是因为随着温度的升高,超临界CO2流体粘度减小,扩散系数增加,CO2流体渗透能力增强,传质速率提高,苦瓜挥发油得率也随之增加。当温度高于50 ℃,超临界CO2流体密度降低,此时扩散系数难以补偿密度减小造成的溶解能力下降。并且继续升高温度可能造成热敏性物质的变性,所以选50 ℃为最佳的温度条件。

图2 萃取温度对苦瓜挥发油得率的影响Fig.2 Influence of extraction temperature on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.1.3 萃取时间对得率的影响 如图3，萃取时间越久萃取越完全,当萃取时间达到90 min后,继续增加时间得率无明显变化,说明此时挥发油已萃取完全,所以选取90 min为最佳萃取时间。

图3 萃取时间对苦瓜挥发油得率的影响Fig.3 Influence of extraction time on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.2 响应面优化结果

根据萃取苦瓜挥发油单因素实验结果结合Box-behnken中心组合原理设计实验,以萃取压力、萃取温度、萃取时间为自变量,以苦瓜挥发油得率为响应值。

分析表2数据得到苦瓜挥发油得率(%)与萃取压力(X1)、温度(X2)和萃时间(X3)3因素得到回归方程:

表2 Box-Behnken试验设计和结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 响应值方差分析表Table 3 Variance analysis of response value

2.2.3 响应面优化条件 从图4可见各因素对响应值的影响，响应曲面的走势及坡度可体现试验因素对响应值的影响。图4b响应面曲线陡峭、等高线密集、形状为椭圆形,表明萃取压力和萃取时间交互作用对苦瓜油得率影响极显著(p<0.01);图4a与图4b相比,响应面曲线走势较平缓、等高线较稀疏、形状为椭圆形,表明萃取压力和萃取温度的交互作用对苦瓜油得率影响显著(p<0.05),但弱于萃取压力和时间的相互作用;图4c响应面曲线走势平缓、等高线稀疏、形状为圆形,表明萃取压力和萃取时间的交互作用对苦瓜油得率影响不明显。

图4 两因素的交互作用对苦瓜挥发油得率的影响Fig.4 Effects of interaction of two factors on the yield of volatile oil from M. charantia L.

通过软件分析得到最佳萃取条件为萃取压力26.97 MPa,萃取温度50.16 ℃,萃取时间88.39 min,苦瓜挥发油最大得率为2.577%,根据实际条件修正后得到最佳条件:萃取压力27 MPa,萃取温度50 ℃,萃取时间90 min,在此条件下进行3次重复实验平均得率为2.56%,响应面分析与实际值误差小,能够预测实验结果。

2.3 成分分析

由超临界CO2萃取出的苦瓜挥发油具有苦瓜特有的香味,经GC-MS检测,其主要成分见表4,总离子流色谱图(图5),采用G1701DA质谱工作站,检索NIST02质谱库,对各个组分进行结构确定,用峰面积归一法对各组分进行定量,得出苦瓜挥发油中不同脂肪酸的相对含量。GC/MS分析结果显示,苦瓜挥发油的成分以酚类、酯类、烷烃类、烯烃类物质为主,与贾素花等[16]报道的苦瓜挥发油相比,其酚类物质百分比含量明显提高,可能是贾素花等采用的蒸馏法所得苦瓜挥发油中酚类物质分子质量小、易挥发、在萃取过程中损失。目前对苦瓜果实、茎、叶[17]挥发油研究较少,且萃取技术多为蒸馏及有机溶剂萃取,本研究采用超临界CO2萃取的苦瓜挥发油酚类含量最高,达到67.33%,其他酯类含量18.54%,烷烃类含量15.54%,烯烃类含量4.15%。

表4 苦瓜挥发油成分组成Table 4 Composition of volatile oil from M. charantia L. extracted with supercritical CO2

图5 苦瓜挥发油总离子流图Fig.5 TIC curves of volatile oils from M. charantia L.

2.4 苦瓜挥发油对RAW 264.7细胞NO释放水平的影响

见表5中脂多糖能诱导RAW 264.7细胞向M1极化,随着苦瓜挥发油浓度的升高,RAW 264.7细胞释放炎症因子NO水平逐渐降低。与模型组相比,16、32 mg/mL剂量的苦瓜油对小鼠NO的分泌水平有具有显著的调节作用,说明苦瓜挥发油具有一定的抗炎作用。研究发现,酚类成分能够下调环氧合酶2及一氧化氮合酶基因表达,升高Bcl-2蛋白表达等降低了炎性因子NO、白介素6、肿瘤坏死因子等释放,增强巨噬细胞吞噬作用,减少炎症损伤的功能[18-22]。苦瓜挥发油的主要成分为酚类,推测苦瓜挥发性酚类能抑制LPS诱导的巨噬细胞释放NO。

表5 苦瓜挥发油对LPS诱导 RAW 264.7巨噬细胞释放NO的影响Table 5 Effects of volatile oil from M. charantia L. on the secretion of NO of RAW 264.7 cells induced by LPS

3 结论

本文研究苦瓜挥发油的超临界CO2萃取工艺优化，分析了挥发油的主要成分,评价了挥发油对炎症因子一氧化氮(NO)释放的影响。超临界CO2流体的萃取温度对苦瓜挥发油得率有极显著性影响(p<0.01),而萃取压力和萃取时间对苦瓜挥发油得率有显著影响(p<0.05),响应面分析得到萃取的最优条件是:萃取压力27 MPa,萃取温度50 ℃,萃取时间90 min,此条件下苦瓜挥发油平均得率为2.56%,与预测结果相近。GC-MS分析结果显示苦瓜挥发油的主要成分为酚类,相对百分含量达到了67.33%。抗炎分析结果表明苦瓜挥发油对LPS诱导的RW 264.7巨噬细胞释放炎症因子NO的抑制有一定的剂量效应,且在挥发油浓度达到16、32 mg/mL时具有显著性差异(p<0.05)。挥发性酚类具有抗炎活性,且为苦瓜挥发油的主要成分,推测苦瓜挥发性酚类是抑制LPS诱导的巨噬细胞释放NO的主要成分。

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