均匀设计法优化葛根素白蛋白微球处方工艺

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(1.桂林医学院药学院，广西桂林 541004； 2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530200)

葛根是我国一种较为常见的中药，其提取物中含有淀粉、纤维素、异黄酮类等成分[1-3]，具有较高的药用价值，葛根也可以作为一种常用的食品，具有一定的保健作用[3-4]。葛根素为异黄酮类化合物，是中药材葛根提取物中的主要活性成分[5]，具有增加冠状动脉血流量、保护心肌缺血细胞、改善微循环，抗血小板聚集，降低心肌耗氧量等多种药理作用[6-7]，被广泛应用于心脑血管疾病和免疫系统疾病的临床治疗之中[1,8]。但其水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低[8-10]，达不到很好的治疗效果，严重限制了葛根素的临床应用，因此，开发一种具有高效生物利用度的葛根素新剂型具有重要的现实意义。

牛血清白蛋白是一种天然的高分子材料，其化学性质稳定、无毒、可生物降解[11]，作为药物载体受到广泛关注，常应用于微球、纳米粒等剂型的制备。牛血清白蛋白微球是以牛血清白蛋白作为载体而制得的一种微米级制剂，可将药物包裹于白蛋白的网状空隙中[12]，利用白蛋白将难溶性药物制备成微球，不仅可以使药物的溶解度增加，还可以保护药物不受外界环境影响，从而提高药物的生物利用度[13-14]。白蛋白微球是近年来靶向剂型的研究热点，作为控制药物释放的新型载体给药系统，还具有缓释性、靶向性，可减少给药次数，降低病患痛苦，使药物在病变组织释药，提高药物有效浓度，减少对人体组织器官的损害和不良反应的发生[15]。

由于药物性质的差异性，制备白蛋白微球的方法也有所不同，如三七总皂苷白蛋白微球采用加热固化法进行制备，而多西他赛白蛋白微球则采用乳化-化学交联法[16-17]。本实验以葛根素为模型药物，牛血清白蛋白微球为载体，采用乳化热固化法制备葛根素白蛋白微球，并通过均匀设计试验对微球制备工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根素对照品 纯度95.5%，中国食品药品检定研究院；牛血清白蛋白 纯度>98%，北京索莱宝生物科技有限公司；75%葛根素 康元医药科技有限公司；司盘80 麦克林；液体石蜡、乙醚 西陇科学股份有限公司。

UV-2550紫外分光光度计 日本岛津公司；DF-101S磁力搅拌器 邦西仪器科技有限公司；CX22RFS1光学显微镜 奥林巴斯；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限股份公司；P60H超声波清洗器 德国elma公司；HC-3618R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根素白蛋白微球的制备 精密称取一定量的葛根素、牛血清白蛋白溶于3 mL水溶液中，超声(37 kHz，5 min)溶解。将上述混匀的混合溶液全部吸入注射器内，缓慢注入60 ℃、5 mL液体石蜡与一定量的司盘80混合，置磁力搅拌器1000 r/min高速搅拌10 min，形成初乳；另取15 mL液体石蜡，油浴加热至120 ℃，将上述初乳在搅拌下缓缓加入，恒温搅拌固化30 min后，冷却至室温，3000 r/min离心10 min，倾去上清液分离微球，沉淀物用乙醚洗涤3～4次，静置挥发乙醚，冷冻干燥得载药微球[18]。

1.2.2 单因素试验 考察牛血清白蛋白、葛根素及乳化剂司盘80添加量对微球包封率和载药量的影响。

1.2.2.1 牛血清白蛋白用量的考察 固定葛根素加入量为20 mg，乳化剂司盘80为0.5 mL，牛血清白蛋白分别取0.1、0.2、0.3、0.4 g，制备微球；

1.2.2.2 葛根素用量的考察 固定牛血清白蛋白用量为0.2 g，乳化剂司盘80为0.5 mL，葛根素分别取10、20、30、40 mg，制备微球；

1.2.2.3 乳化剂司盘80用量的考察 固定葛根素加入量为20 mg，牛血清白蛋白用量0.2 g，乳化剂司盘80分别取0.2、0.3、0.5、0.8 mL，制备微球。

1.2.3 均匀设计试验 以牛血清白蛋白用量、葛根素加入量、司盘80用量为考察因素，见表1。通过U9(96)均匀设计试验优选最佳处方工艺，在Design-Expert软件中选择设计类型(Design type)为历史数据(Historical data)，对数据进行二次曲面方程响应面分析[19]。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 指标的测定

1.2.4.1 葛根素标准曲线的绘制 根据葛根素甲醇溶液紫外扫描图谱，选定248 nm为检测波长。精密称取葛根素对照品5 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得含量为0.1 mg/mL的葛根素对照品溶液。分别精密吸取不同量的对照品溶液稀释成浓度分别为3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg·mL-1的标准溶液。以甲醇溶液作为空白对照，用紫外分光光度计在248 nm处测定其吸光值Y，再以溶液浓度X为横坐标，吸光值Y为纵坐标，绘制出标准曲线。根据葛根素标准曲线测定结果，得到其线性回归方程：Y=0.0836X+0.0106，决定系数R2=0.9993。实验结果表明，葛根素的浓度在3.0～9.0 μg·mL-1与吸光值呈现良好线性关系。

1.2.4.2 包封率和载药量的测定 精密称取微球粉末10.00 mg于研钵中，加入甲醇研磨，研磨至在显微镜观察到微球结构被破坏即可，于超声波细胞粉碎机中50 ℃、150 W超声处理5 min，冷却至室温，微孔滤膜过滤，将滤液转移到50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在248 nm下用紫外分光光度计测其吸光值，根据标准曲线计算微球中葛根素含量，按下列公式计算载药量和包封率[20-21]。

载药量(%)=(微球中的葛根素质量/微球粉末质量)×100

包封率(%)=(微球中的葛根素质量/投药量)×100

投药量=葛根素用量×葛根素的纯度

1.2.4.3 综合评分的确定 以微球的载药量、包封率为指标进行综合评分。评分方法：各指标均以最大值作为参照，所得数据经归一化处理后结合权重系数计算综合分值[17]，综合评分=(包封率/包封率的最大值×0.5+载药量/载药量的最大值×0.5)。

1.2.5 微球形态观察 将少量微球粉末置于载玻片上并用适量纯净水稀释分散，在光学显微镜下观察所制微球的形态[16]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 牛血清白蛋白用量对包封率与载药量的影响 牛血清白蛋白用量对葛根素白蛋白微球包封率与载药量的影响如图1所示，随着牛血清白蛋白用量的增加，包封率与载药量先上升后下降，说明牛血清白蛋白用量在一定范围内能够提高微球的包封率与载药量，当使用量为0.2 g时，包封率与载药量最大，分别为67.36%、6.92%，但是当使用量超过0.2 g时，包封率与载药量均呈下降趋势，这是由于牛血清白蛋白具有表面活性剂的作用，如果表面活性剂的浓度过大，在微球形成过程中会过早的吸附在微球表面，导致包封率与载药量降低[14]，所以选择牛血清白蛋白用量在0.1～0.3 g范围内。

图1 牛血清白蛋白用量对包封率与载药量的影响Fig.1 Effect of Bovine Serum Albumin dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.1.2 葛根素用量对包封率与载药量的影响 如图2所示，葛根素小于30 mg时，随着用量的增加，包封率与载药量逐渐提高；当使用量为30 mg时，包封率与载药量最大，分别为74.12%、7.89%，当使用量超过30 mg时，包封率与载药量均下降，且微球成型性变差，葛根素用量在10～30 mg范围内较合适。

图2 葛根素用量对包封率与载药量的影响Fig.2 Effect of puerarin dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.1.3 乳化剂司盘80用量对包封率与载药量的影响 由图3可知，随着司盘80用量的增加，包封率与载药量呈现出先增加后减少的趋势，当司盘80用量为0.3 mL时，包封率与载药量最大，分别为72.49%、7.54%，说明司盘80用量在一定范围内能够提高葛根素白蛋白微球的包封率与载药量，所以选择司盘80用量在0.3～0.8 mL范围内。

图3 司盘80用量对包封率与载药量的影响Fig.3 Effect of span-80 dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.2 均匀设计法试验

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

表2 均匀设计表及处方测定结果 Table 2 Factors with coded values for uniform design and formulation measure results

2.3 微球的形态

取优化处方工艺制得的微球粉末适量，置于显微镜下观察其形态(见图4)，可见微球外观圆整，大小均匀，无黏连。

图4 葛根素白蛋白微球光学显微镜照片(40×)Fig.4 Light micrograph of puerarin albumin microspheres(40×)

3 讨论与结论

白蛋白微球的制备方法主要有乳化固化法、去溶剂法、聚合法等，本文采用乳化热固化法制备微球，其中葛根素加入量对微球成型有较大影响，当葛根素用量达到一定程度时，制得的微球会出现明显的黏连现象，原因可能是载体牛血清白蛋白所能包裹的葛根素已经饱和，过量的葛根素使微球发生黏连[22]，与文献[18]报道的结果一致。在微球制备过程中，牛血清白蛋白浓度也会影响到葛根素的包封率与载药量，可能是随着牛血清白蛋白用量的增加，最初药物均能被有效包裹，所以包封率和载药量提高，但当其浓度达到一定值后，在微球形成过程中使其过早的吸附在微球表面，从而导致较低的包封率与载药量[14]。实验曾尝试使用乳化化学固化法制备白蛋白微球，但其制得的微球成型性差，重现性差，且交联剂戊二醛具有一定细胞毒性以及变应原性[23]。

本研究在单因素及预实验的基础上，以包封率、载药量为指标，选取了影响较大的3个因素，牛血清白蛋白用量、药物葛根素用量与乳化剂司盘80用量进行3因素3水平的均匀设计试验，得最优处方：牛血清白蛋白为0.20 g，葛根素为30.00 mg，司盘80为0.80 mL，并根据最优处方验证了5批处方，载药量与包封率分别为9.81%±0.14%、76.75%±2.09%，与单因素试验相比，载药量与包封率均有所提高，以优化工艺制备的葛根素白蛋白微球外观为白色粉末，流动性良好。通过优化后的工艺，可获得较为理想的葛根素白蛋白微球。