西双版纳12种食用香料植物精油 抑制炎症因子NO活性研究

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(1.中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源重点实验室,云南勐腊 666303; 2.中国科学院大学,北京 100049)

食用香料植物又叫作香辛料,大多具有芳香、辛辣等刺激性气味,具有杀菌、抗氧化、抗炎等药理作用,用于食物调味调香。从香料植物中提取的物质不仅能改善食物的风味，还可作为天然防腐剂延长食物的保质期[1]。

精油作为香料植物中的主要成分,存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等部位,是植物次生代谢产物,易于挥发并具有愉悦的气味,西方中世纪就已广泛应用[2]。现代药理学研究表明，精油在抗菌[3-4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有重要的作用。Giselle等[8]研究表明,马鞭草精油对组胺等引起的小鼠后肢肿胀具有很好的消肿效果;Sharif等[9]研究表明酸枣果实精油对TPA(佛波酯)诱导的小鼠皮肤炎症有较好的治疗效果;Lin等[10]研究表明台湾肉桂果实精油对细菌脂多糖(LPS)诱导的炎症因子NO、TNF-alpha等的产生具有显著的抑制作用。一氧化氮(NO)作为炎症反应的标志产物之一,正常情况下,体内的NO含量较低[11]。当机体受到外界(物理、化学、生物等)刺激时,iNOS被激活,进而大量合成NO并参与多种疾病的病理反应，如高血压、风湿性关节炎、动脉粥样硬化等[12]。因此,药理学上将是否可以抑制NO合成,作为判断某种物质是否具有抗炎活性的重要指标。目前,临床上抗炎药有两大类:甾体类和非甾体类。由于抗炎药的过度使用,耐药性、毒副作用及新的相关病症增加,迫切需要寻找新的低毒、高效的新型抗炎药[13]。

西双版纳地处我国云南南部,芳香类植物十分丰富,这里是傣族为主的少数民族聚居地,当地各民族传统用各种香料植物防治蚊虫叮咬、清热解毒、消肿止痛。据文献及对当地药用植物调查选取以下12种具有药食两用的芳香植物作为研究对象,其性状如下:跳蚤草(AdenosmabuchneroidesBonati.):草本,生长于海拔580～900 m,具特殊香气[14];锡兰肉桂(CinnamomumverumPresl.):常绿乔木,枝干灰色具白斑,叶革质或近革质对生[15];水香薷(ElsholtziakachinensisPrain.):草本,茎具绒毛,叶卵形或卵状披针形,基部以上具圆齿,两面疏被绒毛[16];野拔子(E.rugulosaHemsl.):草本至半灌木,茎多分枝,密被白色绒毛,叶卵形,椭圆址菱状卵形[17];草八角(Limnophilarugose(Roth)Merr.):多年生宿根草本,叶卵形边缘具齿,茎叶具八角香气[14];山苍子[Litseacubeba(Lour.)Pers.]:灌木或小乔木,叶互生,披针形或长圆形,具芳香气味[18];蒜香藤[Mansoaalliacea(Lam.)A.H.Gentry.]:常绿藤状灌木,具卷须,二出复叶,深绿椭圆形,有大蒜气味[19];小芸木[Micromelumintegerrimum(Buch-Ham.)Roem.]:小乔木,树皮灰色,叶轴、花序均绿色,密被绒毛,成熟果实黄色,具香气[14];毛叶丁香罗勒(OcimumgratissimumLinn. var.suave(Willd.)Hook.f.):丁香罗勒于薄荷罗勒杂交种,多年生灌木,叶、茎具芳香气味[20];马来树胡椒(PiperarborescensRoxb.):小乔木,树皮灰色,叶轴、花序均绿色,密被绒毛,成熟果实黄色,具香气[14];巴西树胡椒(P.hispidinervumC. DC.):常绿丛生灌木,呈小乔木状,枝叶、果芳香[14];清香木(PistaciaweinmannifoliaJ. Poisson ex Franch.):灌木或小乔木,小叶叶柄被绒毛,革质,长圆形或倒卵状长圆形[14]。因此推测这些芳香植物具有抗炎的效果,对炎症相关因子NO具有较好的抑制作用。此前已有很多文献报道这里芳香植物的成分[14],但对其抗炎功效的研究报道较少。

本研究选用对炎症反应较为敏感的RAW264.7细胞,测定12种香料植物精油的抗炎活性,并通过GC-MS联用技术,对具有显著抑制作用的植物精油的化学成分进行测定,为这些植物精油提供抗炎作用的理论依据，并为其可能发挥治疗炎症并发症(糖尿病、动脉粥样硬化等)的作用提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用香料植物 具体信息见表1,均采自中科院西双版纳热带植物园;小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7 中国科学院昆明动物研究所动物种质资源库。青/链霉素、DMEM高糖培养基 Hyclone公司;胎牛血清、谷氨酰胺 Gibco公司;磷酸盐缓冲液、LPS、地塞米松(Dex)、二甲基亚砜(DMSO) Sigma公司;NO检测试剂盒、MTS([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑,内盐]试剂盒 Promega公司。

表1 实验材料Table 1 Experiment materials

REF5250040多功能酶标仪 美国Thermo scientific;Agilent 7890/5975C GC-MS气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent Technologies;98-1-B电热套 天津市泰思特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物精油的提取 精油提取:采集新鲜所需材料,去除腐烂及发霉材料,自然阴干,粉碎。称取一定质量的材料加入去离子水,采用水蒸气蒸馏法,沸腾的同时在精油接受口用500 mL锥形瓶(其中加入20～30 mL乙醚)提取精油。乙醚及精油被收集在一起,之后通过旋转蒸发去除乙醚。置于冰箱(4±2) ℃保存[23]。

1.2.2 细胞活力评估 用含10%胎牛血清,1000 U/L青、链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基置于37 ℃ 含5% CO2的生物安全柜中培养RAW264.7细胞。取对数生长期RAW264.7细胞制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液,种于96孔板中。每孔100 μL,每组3个平行,贴壁培养18 h。吸去原有培养基,PBS洗两次,空白组更换为新鲜培养基,LPS组加入含浓度为1 μg/mL LPS各100 μL,其他组加入含不同浓度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)的培养基,继续培养24 h。按照每孔20 μL的比例加入MTS,于490 nm处测定吸光度值[24]。

1.2.3 NO含量测定 将处于对数生长期的RAW264.7细胞按照1×106个/mL接种于96孔板中,每孔100 μL。设置空白对照组(C组)、Dex组(100 μL/孔培养基中含浓度为1 μg/mL LPS及10 μmol/L Dex)、LPS组(1 μg/mL LPS 100 μL/孔),不同精油+LPS组(不同种浓度精油+LPS浓度为1 μg/mL),每组3个平行。贴壁18 h后,用不同浓度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)预处理30 min,Dex预处理浓度为10 μmol/L。之后除空白组外其余各组均用含1 μg/mL LPS培养基孵育24 h。10000 r/min,5 min后,收集上清,按照Griess试剂盒操作说明,对上清中NO含量进行检测[25]。

1.2.4 具有明显抑制作用精油成分测定 成分测定:采用气相色谱-质谱联用仪进行成分分析,方法如下:吸取一定体积精油加入合适的溶剂(CH2CL2或正己烷)进行溶解,置于自动进样器,设置相应的参数,运行。

气相条件:色谱柱:Agilent 19091J-115,HP-5(5% Phenyl Methyl Siloxan,50 m×0.32 mm×0.52 um);进样口温度:250 ℃;柱箱升温程序:50 ℃起始,以5 ℃/min的速率从100 ℃,保持5 min,然后以25 ℃/min的速率从100 ℃升到250 ℃保持5 min;进样量:1 μL分流比50∶1;进样口压力:90 kPa;流速:1.8 mL/min。

质谱条件:电离方式EI,电子轰击能量70 eV,扫描范围m/z 50～550;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃。

化学成分鉴定:采用NIST14数据库对质谱图进行自动检测,参考相关文献中质谱资料(线性保留指数由一系列直链烷烃在HP-5(C8～C30)毛细管色谱柱的保留时间计算决定)[25],最终对精油的化学成分进行定性分析(RI计算公式为IX=RI1+[RI2-RI1]/[RT2-RT1]×[RT2-RTX],其中IX为计算化合物的保留指数,RI1,RTX,RT2分别为前面化合物,待计算化合物及后面化合物的保留时间,RI1,RI2分别为前面化合物和后面化合物的保留指数)。色谱峰面积运用归一化定量,计算得出各组分百分含量。

1.3 数据处理

实验数据采用Graph Prism 5.0进行分析,组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用Dunnett’s t-test检验,计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示,p<0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 12种植物精油对RAW264.7细胞活性的影响

图1～3均与C组比较,图4～6均与LPS组比较。*表示差异显著(p<0.05)**表示差异极显著(p<0.01)***表示差异高度显著(p<0.001),图2～图6同。图1～图3表示精油浓度在一定范围内,各种来源的植物精油对RAW264.7细胞活力的影响。马来树胡椒精油在浓度为0.005%对细胞有显著抑制作用(p<0.05),细胞活力降至81.62%，蒜香藤精油在浓度为0.004%及0.005%是对细胞有高度显著抑制作用(p<0.001),细胞活力降至64.18%、54.32%,因此，未进行后续NO含量的测定。精油作为一种混合物,可能是其中的多种成分共同起作用,表现出对RAW264.7细胞一定的抑制作用;巴西树胡椒精油、跳蚤草精油、小芸木精油、山苍子叶精油浓度在0.001%～0.005%范围内对细胞活力有一定的促进作用，但差异不显著(p>0.05),水香薷精油、锡兰肉桂精油、野拔子精油、清香木精油、草八角精油、毛叶丁香罗勒精油浓度在0.001%～0.005%范围内对细胞活力无显著影响(p>0.05)。与Li等[25]、董丽华等[26]报道的麻欠、花椒精油对细胞活力的影响结果类似。

图1 植物精油对RAW264.7细胞活力的影响Fig.1 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

图3 植物精油对RAW264.7细胞活力的影响Fig.3 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

2.2 各种精油对LPS诱导的NO产生的影响

图4～图6,表明在0.001%～0.005%浓度范围内,在LPS刺激24 h后,空白组细胞NO产生量分别为:(2.33±0.13)、(0.89±0.08)、(1.31±0.03) μmol/L,LPS组NO生成量显著升高为:(40.69±0.79)、(46.44±1.78)、(40.53±0.96) μmol/L,与杨晶晶[25]等的造模结果类似,表明造模成功;而马来树胡椒精油、锡兰肉桂精油、水香薷精油在浓度为0.001%～0.005%浓度范围内对NO产生具有高度显著抑制作用(p<0.0001),清香木精油在0.002%～0.005%浓度范围内对NO产生具有高度显著抑制作用(p<0.0001)、毛叶丁香罗勒精油(0.005%)、蒜香藤精油(0.002%)对NO的产生具有高度显著的抑制作用(p<0.0001),并呈浓度依赖型,上述精油中，除毛叶丁香罗勒及蒜香藤外,其他精油在(0.001%～0.005%)浓度范围内抑制效果均优于阳性对照地塞米松(Dex)。抑制强度顺序为马来树胡椒>水香薷>锡兰肉桂>清香木>蒜香藤>毛叶丁香罗勒。

图4 植物精油对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响Fig.4 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

图5 植物精油对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响Fig.5 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

图6 植物精油对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响Fig.6 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

2.3 具有显著抑制作用精油的成分分析

对具有显著抑制效果的马来树胡椒、锡兰肉桂、清香木、毛叶丁香罗勒、蒜香藤和水香薷的精油成分进行了分析,结果见表2～表7。

表7 水香薷精油主要化学成分(含量大于1%)Table 7 Chemical compositions of E. kachinensis Essential oil

表2 马来树胡椒精油主要化学成分(含量大于1%)Table 2 Chemical compositions of P. arborescens essential oil

图7 马来树胡椒精油气相色谱图Fig.7 The GC-MSFigure of P. arborescens essential oil

马来树胡椒精油化学成分共鉴定出74种化合物。含量在1%以上的有9种,如表2所示,含量最高的为洋元荽醚(57.28%),其他含量较高的依次为百里酚:7.43%,双环[7.2.0]碳-4-烯:3.09%,p-伞花烯:2.87%。

图8 锡兰肉桂精油气相色谱图Fig.8 The GC-MSFigure of C. verum essential oil

锡兰肉桂精油化学成分共鉴定出26种化合物。含量在1%以上的有6种,如表3所示,含量最高的为5-烯丙基愈创木烯为84.03%,其他依次为反式肉桂醛4.63%,1-石竹烯3.45%。

表3 锡兰肉桂精油主要化学成分(含量大于1%)Table 3 Chemical compositions of C. verum essential oil

图9 清香木精油气相色谱图Fig.9 The GC-MSFigure of P. weinmannifolia essential oil

清香木精油化学成分共鉴定出化合物58种。含量在1%以上的有14种,如表4所示,含量最高的为α-蒎烯:43.39%,其次依次为D-柠檬烯:9.12%,β-蒎烯:7.76%,莰烯:6.61%等。

表4 清香木精油主要化学成分(含量大于1%)Table 4 Chemical compositions of P. weinmannifolia essential oil

图10 毛叶丁香罗勒气相色谱图Fig.10 The GC-MSFigure of O. gratissimum essential oil

毛叶丁香罗勒精油化学成分共鉴定出化合物40种。含量在1%以上的有6种,如表5所示,含量最高的为丁香酚苯乙醚:67.29%,其他依次为1,3,6-罗勒烯:13.62%,4-异丙基-3-甲基苯酚:3.69%等。

表5 毛叶丁香罗勒精油主要化学成分(含量大于1%)Table 5 Chemical compositions of O. gratissimum essential oil

图11 蒜香藤精油气相色谱图Fig.11 The GC-MSFigure of M. alliacea essential oil

蒜香藤精油化学成分共鉴定出22种化合物。含量在1%以上的有6种，如表6所示,含量最高的为二烯丙基二硫醚:56.54%,其他依次为二烯丙基三硫醚:24.06%,二烯丙基硫醚:4.77%,1-辛烯-3-醇:4.74%,二烯丙基四硫醚:4.09%等。

表6 蒜香藤精油主要化学成分(含量大于1%)Table6 Chemical compositions of M. alliacea essential oil

图12 水香薷精油气相色谱图Fig.12 The GC-MSFigure of E. kachinensis Essential oil

水香薷精油化学成分共鉴定出31种化合物。含量在1%以上的有6种，如表7所示,含量最高的为D(+)-Carvone(右旋香芹酮):46.53%,其他依次为1-(3-甲基-2-呋喃基)-3-甲基-2-丁烯-1-酮:33.13%,1-Octen-3-ylacetate(1-辛烯-3-醇乙酸酯):4.64%等。

通过GC-MS对其成分进行分析可知,抗炎活性成分可能与精油中的D-柠檬烯、α-蒎烯[27-31]、肉桂醛[32]等物质相关。蒜香藤中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等和大蒜中的成分类似,这些可能是蒜香藤中的抗炎活性物质[33]。

3 结论

本实验选取西双版纳地区12种食用香料植物精油作为研究对象,首次报道跳蚤草、水香薷、野拔子、草八角、蒜香藤、小芸木、毛叶丁香罗勒、马来树胡椒、巴西树胡椒等精油的抗炎活性。其中马来树胡椒精油、锡兰肉桂精油、清香木精油、毛叶丁香罗勒精油、蒜香藤精油和水香薷精油对炎症因子NO的产生具有显著的抑制效果。其抑制NO活性大小依次为马来树胡椒>水香薷>锡兰肉桂>清香木>蒜香藤>毛叶丁香罗勒。上述精油中,低浓度的马来树胡椒精油表现出更好的抗炎效果且对细胞活力无显著影响。通过GC-MS对马来树胡椒精油、巴西树胡椒精油、毛叶丁香罗勒精油等成分进行分析,精油成分以烯烃类为主,其主要成分多样,抗炎作用可能是多成分共同作用。本研究为傣族人民对这些植物的传统药用及食用提供了科学的依据。此外,马来树胡椒精油、锡兰肉桂精油、清香木精油、毛叶丁香罗勒精油等作为一种天然抗炎材料在药用及功能食品产业等方面具有较大的潜力。这些植物精油抗炎活性机制有待进一步研究。