部分紫色蔬菜中酚类物质 及维生素C含量分析

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(1.青海大学农牧学院,青海西宁 810016; 2.江苏省食品质量安全重点实验室,江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所,江苏南京 210014)

蔬菜在我国居民饮食中占据着重要的地位,现有大量流行病学研究显示,蔬菜摄入量越多,多种疾病如糖尿病、肥胖、心血管病等发生风险越低[1-2]。紫色蔬菜,如紫甘蓝、紫薯、紫茄等,由于含有丰富的花青素及其他酚类成分而备受关注[3]。花青素是一类水溶性天然色素,也是紫色蔬菜中主要呈色物质,属黄酮类化合物。花青素在果蔬中存在的种类多样,其中矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、芍药素、锦葵素、矮牵牛素最为常见,其在果蔬中分布概率分别约为50%、12%、12%、12%、7%和7%[4]。花青素通常与糖类结合形成糖苷或被酸类酰化,以花色苷的形式存在于紫色植物中,已有多项研究证明其具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变等多种生理活性功能[5-6]。

目前,围绕蔬菜中花青素的研究较多,多集中在其生理活性功能、合成代谢途径、调控基因表达等[5,7]。蔬菜中花青素含量分析研究也较多,对象主要为紫甘蓝[8-9]、紫茄[10]以及紫薯[11],其他紫色蔬菜花青素分析研究寥寥无几。此外,由于已有研究中大多针对一种蔬菜,各研究中采用的提取、纯化、检测方法各有不同,结果表述方式亦各有不同,很难形成对各种紫色蔬菜中花青素含量的统一认识。且由中国疾病预防控制中心发布的《中国食物成分表》中尚无花青素含量相关信息。

本试验以我国常见部分紫色蔬菜紫甘蓝、紫背天葵、红苋菜、紫薯、紫茄、紫洋葱为样品,研究其中以花青素为主的酚类物质及维生素C含量差异,分析比较紫色蔬菜营养品质。以期明确各紫色蔬菜营养品质差异,为高营养品质蔬菜品种推荐及消费者饮食消费选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜紫甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitataf,rubra)、紫背天葵(BegoniafimbristipulaHance)、红苋菜(Amaranthustricolor)、紫薯(IpomoeabatatasL.)、紫茄(Solanummelongena)、紫洋葱(AlliumcepaL.) 均购自南京蔬菜市场,每种蔬菜采集样品10个,取可食部分待测(由于紫茄花青素主要集中在皮,故而取2～3 mm茄皮与茄肉分开检测);飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素、锦葵素标品,纯度≥96% 上海宝曼生物科技有限公司;芦丁、没食子酸,纯度≥98% 上海源叶生物科技有限公司;乙腈、甲酸(色谱纯) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水乙醇、氯化钾、醋酸钠、盐酸、亚硝酸钠、福林酚等(分析纯) 南京化学试剂股份有限公司。

Agilent 1260高效液相色谱(配有二极管阵列检测器(DAD)) 美国Agilent公司;Alpha-1506紫外可见分光光度计 上海谱元公司;A11高速冷冻研磨机 德国IKA集团。

1.2 实验方法

1.2.2 花青素的测定 采用液相色谱法测定。采用外标法定量。选取常见六种花青素标品包括矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、芍药素、锦葵素及矮牵牛素,配制0.2～100 μg/mL的标准溶液测定绘制标准曲线;取花色苷提取液放入沸水浴中水解1 h,取出立即冷却后过0.45 μm滤膜,待测。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5.0 μm);流动相A为含1%甲酸的水,B为含1%甲酸的乙腈;进样量为20 μL;柱温35 ℃;检测波长为525 nm;流速0.8 mL/min;梯度洗脱程序为0～10 min,流动相A 92%～80%;10～20 min,流动相A 80%～20%;20～30 min,流动相A 20%～92%。

1.2.3 总花色苷的测定 按照pH示差法测定总花色苷,具体见Tong等[13]的方法。取花色苷提取液，分别用0.025 mol/L pH1.0的氯化钾缓冲液和0.4 mol/L pH4.5的醋酸钠缓冲液稀释,避光平衡20 min后,紫外分光光度计525 nm和700 nm处测定吸光值,以矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy3G)为当量进行计算,样品中总花色苷以mgCy3G/100 g样品表示。

花色苷含量(mg/mL)=A×MW×DF/b

式(1)

式中,A=(Amax-A700)pH1.0-(Amax-A700)pH4.5,MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量=449.2,DF为稀释倍数,b为摩尔吸光度=26900。

1.2.4 维生素C的测定 采用GB5009. 86-2016《食品中抗坏血酸的测定》中2,6-二氯靛酚滴定法测定维生素C含量。称取样品10 g,粉碎后加入10 g草酸溶液捣成匀浆。准确称取5 g匀浆样品至50 mL容量瓶,稀释至刻度后过滤。准确吸取10 mL滤液,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色15 s不褪色为止。

T=(C×V)/(V1-V0)

式(2)

式中,T-2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数,mg/mL;C-抗坏血酸标准溶液的质量浓度,mg/mL;V-吸取抗坏血酸标准溶液的体积,mL;V1-滴定抗坏血酸标准溶液所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,mL;V0-滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,mL。

X=[(V-V0)×T×A]/m×100

我国在“一带一路”建设过程中，应认清形势，明确发展任务，集中力量推动“一带一路”来华留学生教育[8]。基于我国高校在“一带一路”来华留学生教育方面存在的上述问题，特提出如下发展对策与建议。

式(3)

式中,X-试样中抗坏血酸含量,mg/100 g;V-滴定试样所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,mL;V0-滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,mL;T-2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数 mg/mL;A-稀释倍数;m-试样质量,g。

1.2.5 总黄酮的测定 按照铝离子显色法测定,具体见梁颖等[14]的方法。新鲜蔬菜置于高速冷冻研磨机中,加入液氮研磨1 min,称取5 g粉碎样,加入15 mL乙醇水溶液(7∶3,V/V)振荡提取10 min,提取两次,合并提取液后10000 r/min离心2 min,上层即为提取液。取250 μL提取液加入150 μL 5%的NaNO2溶液,静置6 min后再加入300 μL10%的氯化铝,静置5 min后再加入1.5 mL 1 mol/L的NaOH,蒸馏水定容体积至5.0 mL。静置15 min后紫外分光光度计510 nm处测定吸光值,以芦丁当量(Rutin equivalents,RE)进行计算,样品中总黄酮含量以mg RE/100 g样品来表示。标准方程为y=0.0109x+0.0011(R2=0.9991),其中,x-总黄酮浓度(μg/mL);y-吸光度。

1.2.6 总酚的测定 按照福林酚比色法测定,具体见李艺等[15]的方法。蔬菜样品提取同1.2.4。取1 mL提取液加入6 mL蒸馏水,再加入0.5 mL 1.0 mol/L福林酚试剂,漩涡振荡,避光放置3 min后加1.5 mL 20%碳酸钠溶液,定容,混匀后室温放置2 h,紫外分光光度计765 nm下测定吸光值,以没食子酸当量(Galic acid equivalents,GAE)进行计算,样品中总酚含量以 mg GAE/100 g 样品来表示。标准方程为y=0.1283x+0.0226(R2=0.9991),其中,x-总酚浓度(μg/mL);y-吸光度。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据统计分析,数据均为三次重复实验的均值±标准方差,并进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 花青素标准曲线绘制

图1为花青素标准品的液相图谱,其中横坐标为出峰时间(min),纵坐标为峰度(mAu),出峰依次为飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素以及锦葵素。表1为花青素的标准曲线方程,其中y为峰面积,x为标样浓度(μg/mL),R2≥0.999,检出限≤0.06 μg/mL,定量限≤0.21 μg/mL。

表1 花青素标准曲线方程Table 1 Standard curve equation of anthocyanidins

图1 花青素标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of anthocyanin standards注:1.飞燕草素;2.矢车菊素;3.矮牵牛素; 4.天竺葵素;5.芍药素;6.锦葵素。

2.2 紫色蔬菜中花青素组成及含量

由表2可以看出,紫色蔬菜中仅有飞燕草素、矢车菊素和芍药素三种花青素检出,而矮牵牛素、天竺葵素以及锦葵素均未检出。紫甘蓝、紫背天葵及紫洋葱中仅检出矢车菊素,含量分别为44.52、2.86、2.93 mg/100 g,紫甘蓝中矢车菊素含量显著高于紫背天葵和紫洋葱(p<0.05);紫茄皮中仅检出飞燕草素,且含量较高,为38.72 mg/100 g;紫薯中检出有芍药素及少量矢车菊素,含量分别为5.10及0.64 mg/100 g。红苋菜及紫茄肉中均未有目标花青素检出。

表2 紫色蔬菜中花青素组成及含量Table 2 The composition and contents of anthocyanidin in purple vegetables

已有多项研究均显示紫甘蓝中仅含有矢车菊素[16-17],紫茄中仅含有飞燕草素[18-20],Gras等[21]和Truong等[22]研究中均显示紫薯中芍药素含量较高,矢车菊素含量较低,这与本文研究结果趋势一致。目前仅Shimizu等[23]报道紫背天葵中含有矢车菊素,可为本文佐证。紫洋葱花青素的研究报道很少,仅有Fossen等[24]和刘玉芹等[25]发现紫洋葱中的花色苷主要为矢车菊素以及少量芍药素,本文紫洋葱中未检出芍药素,极有可能是样品品种不同所致。红苋菜尚未有研究报道其花青素组成及含量,而本文红苋菜中未有常见六种花青素检出,红苋菜中花青素含量低可能为主要原因,也有可能其所含的甜菜碱对检测影响所致,具体情况如何还需后续进一步研究。

总花色苷含量在紫甘蓝中最高,为98.01 mg Cy3G/100 g,其次为紫茄皮,为60.78 mg Cy3G/100 g,紫薯、紫洋葱以及紫背天葵含量较低且紫薯与其二者之间差异不显著(p>0.05)。总花色苷含量趋势与花青素基本相同。

2.3 紫色蔬菜中VC含量

图2为各紫色蔬菜中VC含量。由图2可以看出,紫甘蓝中VC含量最高,为22.52 mg/100 g,显著高于其他紫色蔬菜(p<0.05),其次为红苋菜、紫洋葱,含量分别为4.56和2.76 mg/100 g且差异不显著(p>0.05),紫薯含量为1.51 mg/100 g,紫背天葵和紫茄皮、紫茄肉VC含量均较低,小于1 mg/100 g,紫茄皮中VC含量为0.25 mg/100 g,紫茄肉VC含量为0.09 mg/100 g,是紫茄肉的2倍以上。

图2 紫色蔬菜中VC含量Fig.2 The contents of VC in purple vegetables 注:不同字母表示紫色蔬菜间VC含量差异显著(p<0.05)。

《中国食物成分表》中显示甘蓝、苋菜、豆薯、洋葱及紫茄中VC含量分别为40、30、13、8及7 mg/100 g,整体较本文研究结果高,可能是检测方法及蔬菜品种不同所致。《中国食物成分表》中VC含量检测采用荧光检测法,可检测还原型及脱氢型VC;本实验采用2,6-二氯靛酚滴定法,主要检测还原型VC。蔬菜中VC主要以具有生物活性的还原型VC形式存在,同时也有小部分脱氢型VC,故而《中国食物成分表》中VC含量较高。同时,蔬菜品种众多,同种蔬菜各品种间存在的差异也会影响结果的一致性。《中国食物成分表》中各种蔬菜VC含量高低差异趋势与本文基本相同,皆为甘蓝中VC含量最高,其次为苋菜,洋葱及紫薯居中,紫茄含量较低。

2.4 紫色蔬菜中总黄酮含量

图3为紫色蔬菜中总黄酮含量。由图3可以看出,紫茄皮、紫甘蓝及红苋菜中总黄酮含量均较高,分别为119.48、111.75及99.19 mg RE/100 g且差异不显著(p>0.05),其次为紫背天葵、紫洋葱和紫茄肉,紫薯中总黄酮含量最低,为38.37 mg RE/100 g,显著低于其他紫色蔬菜(除紫茄肉及紫洋葱)(p<0.05)。花青素是黄酮中重要的一类物质。紫甘蓝和紫茄皮中总黄酮量最高,分别为111.75、119.48 mg RE/100 g,其花青素含量亦是最高,为44.52及38.72 mg/100 g,说明花青素为紫甘蓝和紫茄皮中主要黄酮成分。

图3 紫色蔬菜中总黄酮含量Fig.3 The contents of total flavonoids in purple vegetables 注:不同字母表示紫色蔬菜间总黄酮含量差异显著(p<0.05)。

《中国食物成分表》中未有黄酮类营养成分检测的数据,已有文献中蔬菜总黄酮的测定以一种目标蔬菜为主。Maria等[26]研究发现紫甘蓝中总黄酮含量在38.6～41.4 mg槲皮素/100 g fw,Umma等[27]报道红苋菜中总黄酮含量为12.60 mg RE/100 g dw,程爱青等[28]研究结果中显示洋葱中总黄酮含量为10.62 mg槲皮素/100 g fw,周佳等[29]发现洋葱中总黄酮含量为39 mg RE/100 g fw。由文献分析可知,不同文献中结果表述多不同,包括干重、湿重差异,当量物质差异等,不宜直接比较各种蔬菜总黄酮含量差异。其中周佳[29]对紫洋葱中总黄酮与总酚的研究结果与本研究结果相近,均表明总酚含量大于总黄酮,可佐证本文结果准确性。

2.5 紫色蔬菜中总酚含量

由图4可以看出,紫洋葱中总酚含量为96.55 mg GAE/100 g,显著高于其他紫色蔬菜(p<0.05),其次为紫甘蓝、紫茄皮,含量分别为83.22、75.98 mg GAE/100 g，且紫甘蓝和紫茄皮的差异不显著(p>0.05),红苋菜、紫薯、紫背天葵及紫茄肉中总酚含量较低。

图4 紫色蔬菜中总酚含量Fig.4 The contents of total phenolics in purple vegetables 注:不同字母表示紫色蔬菜间总酚含量差异显著(p<0.05)。

《中国食物成分表》中未有酚类营养成分检测的数据。Mia等[30]检测了新加坡多种蔬菜中总酚含量,发现各蔬菜中甚至是同种蔬菜中不同品种其总酚含量差异非常大,其中紫甘蓝中总酚含量为 186 mg GAE/100 g,本文紫甘蓝总酚含量低于Mia的报道,极有可能是品种差异所致;Bilal等[31]对26种紫茄品种中总酚含量进行检测,发现其含量范围在61.5～138.9 mg GAE/100 g。

3 结论

紫色蔬菜中花青素组成和含量以及其他营养成分均具有较大差异。花青素中飞燕草素、矢车菊素和芍药素在紫色蔬菜中有检出,其中紫甘蓝、紫背天葵、紫洋葱中均检出矢车菊素,紫甘蓝显著最高,为44.52 mg/100 g(p<0.05),紫茄皮中有飞燕草素检出,紫薯中同时检出有芍药素及少量矢车菊素,红苋菜及紫茄肉中未有目标花青素检出,总花色苷趋势与花青素基本相同。紫甘蓝中VC含量显著最高,为22.52 mg/100 g(p<0.05),其次为红苋菜、紫洋葱和紫薯;紫茄皮、紫甘蓝及红苋菜中总黄酮含量均较高;而紫洋葱中总酚酸含量显著最高,为96.55 mg GAE/100 g(p<0.05),其次为紫甘蓝,紫茄皮。综合分析,紫甘蓝在目标紫色蔬菜中营养品质最高,而紫洋葱总酚酸含量最高,红苋菜VC及总黄酮含量较高;紫茄、紫背天葵和紫薯各营养成分含量不突出。紫色蔬菜中花青素组成和含量以及其他营养成分特点可作为特定人群蔬菜消费的选择依据,同时亦可为居民营养物质饮食摄入评估提供基础数据。