卷丹百合珠芽发育进程中矢车菊素的积累动态

张丽萍，张 恪，唐 楠，唐道城

(青海大学高原花卉研究中心，青海省园林植物重点实验室， 青海西宁 810006)

卷丹百合(Liliumlancifolium)属百合科百合属卷瓣组，在我国广泛分布。珠芽是卷丹百合特有器官，是由腋芽发育而成的小鳞茎，紫色，富含多种营养物质和花青素。花青素是广泛存在于植物中的水溶性色素，种类多样，结构复杂，从而导致植物的花和果实等呈现多种色彩[1-2]。花青素并不是一直存在于植物组织中，而是在特定的发育时期才合成[3-4]。目前国内关于卷丹百合的研究主要集中于鳞片繁殖、组织培养和脱毒快繁技术、高产栽培技术[5-7]等方面。Markakis[8]首次将HPLC法应用于单个花色苷的分离；叶兴乾等[9]采用纸层析、高效液相色谱(HPLC)、光谱分析等方法对荸荠种杨梅的花色苷进行研究，分离鉴定出其主要成分为矢车菊花色苷元-3-葡萄糖苷。由于花青素的结构类型多，其成分复杂，易受提取分离的仪器、分离柱及温度等的影响，因此在利用HPLC法测定花青素之前需要进行色谱条件的筛选与优化。笔者利用HPLC法测定卷丹百合珠芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量，首先对HPLC的色谱条件进行优化，然后对不同发育期珠芽提取物中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量进行测定，旨在了解珠芽发育进程中矢车菊素的动态变化，以期为卷丹百合珠芽中花青素开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂材料：珠芽采自互助县威远镇青海互丰农业科技集团公司实验田，实验田土壤为栗钙土，年平均温度4.5 ℃，平均降水量约400 mm。

标准品：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品纯度≥95%(SIGMA公司)。

1.2仪器与设备高效液相色谱仪(Agilent 1260)、C18固相色谱柱(5 μm，4.4 mm×150 nm Agilent ZORBAX SB-C18)、上海申顺科技R-21旋转蒸发仪。

1.3试验方法

1.3.1采样。从珠芽形成起始叶节，由下向上，对各株第3～5叶节的珠芽进行定位取样。每14 d取珠芽样1次，每次取3个重复，每重复至少30粒。

1.3.2标准液的制备。准确称取1.00 mg标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷溶于1.00 mL 1%盐酸甲醇溶液中配制成1 mg/mL的标准溶液，然后用1%盐酸甲醇溶液稀释成2、10、20、50、100 μg/mL标准品待测液，置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.3样品待测液的制备。参考文献[10-16]的方法并加以改进，将珠芽冰上迅速切碎混合后液氮研磨成粉末，置于-80 ℃超低温冰箱中保存。取1.0 g珠芽粉末，加入提取液(体积分数1%盐酸甲醇)40 mL，4 ℃下静置萃取48 h，取上清液用滤纸粗滤，旋转蒸发浓缩，0.45 μm微孔滤膜过滤，用体积分数1%盐酸甲醇定容至25 mL，供上样用。

1.4试验设计筛选HPLC的测定条件时以标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷50 μg/mL进行检测。

1.4.1流动相初选。Ⅰ.V(1%甲酸水溶液)∶V(1%甲酸乙腈溶液)=94∶6[10]；Ⅱ.V(0.04%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=95∶5[11]；Ⅲ.V(4%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=88∶12(pH2.0)[12]；Ⅳ.V(10%醋酸水溶液)∶V(1%甲酸乙腈溶液)=90∶10[13]；Ⅴ.V(2%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=94∶6[14]；Ⅵ.V(0.5%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=88∶12[15]；Ⅶ.V(10%甲酸水溶液)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=94∶3∶3[16]。

1.4.2波长选择。波长设定为510、515、520、525、530、535、540、545 nm。

1.4.3柱温选择。柱温设定为20、25、30、35、40、45 ℃。

1.4.4流速选择。流速设定为1.2、1.0、0.8、0.5、0.3 mL/min。

1.4.5矢车菊素定性分析。利用该试验优化确定的Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相A(0.04%甲酸水溶液)∶B(乙腈)=95∶5；流速0.5 mL/min；检测波长520 nm；自动进样10 μL；柱温35 ℃，采用梯度洗脱，对标准品进行测定。

1.4.6矢车菊素定量分析。将5个不同浓度的标准品进行检测。以峰面积为纵坐标(y)，矢车菊色素浓度为横坐标(x)，得到花青素标准曲线的线性回归方程及相关系数。

1.4.7回收率测定。分别精确吸取一定量的标准品溶液，加入到已知量的样品中，按测定样品含量的方法，测得3个浓度标准品的平均回收率。

1.4.8精密度测定。取同一批次的珠芽样品溶液10 μL，连续进样5次(n=5)，测定样品花青素中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的峰面积，计算精密度RSD。

2 结果与分析

2.1珠芽的发育进程由图1可知，当植株叶节生长到12～14节时，珠芽开始形成，珠芽集中分布在12～60个叶节。 从珠芽形成到形态发育成熟约经历91 d。珠芽形成过程大致可以分成“鱼雷期”“胎儿期”和“球形期”3个时期(图1)，进入球形期后标志着形态发育基本“成熟”，并开始脱落。

注：a.鱼雷期；b.胎儿期；c.球形期Note:a.Torpedo period;b.Fetal period;c.Spherical period.图1 卷丹百合珠芽的形态变化Fig.1 The morphological changes of bulblet from Lilium lancifolium

2.2HPLC测定参数的优化

2.2.1流动相。通过对7个流动相的保留时间、峰宽、峰高、峰面积及对称因子等(表1)各因素的综合考虑，初步选择流动相Ⅱ作为较优流动相。由于流动相Ⅱ中的乙腈价格较高，后将乙腈换为甲醇，改后对出峰时间和峰面积均无不良影响。

表1 7个流动相色谱参数

2.2.2波长。由表2可知，波长520 nm处的峰高和峰面积最大，其余参数与各波长相近，故选择520 nm作为优选波长。

表2 HPLC法不同波长色谱参数

2.2.3柱温。选择峰面积率最高、对称因子较高的35 ℃作为优选柱温(表3)。

表3 不同柱温色谱参数

2.2.4流速。由表4可知，流速0.5 mL/min时出峰时间适中(9.655 min)，峰高适宜(72.470)，峰面积率较高(76.21%)，因此选用流速0.5 mL/min。

表4 不同流速色谱参数

2.2.5矢车菊素定性分析。利用该试验优化的色谱条件，对标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)进行测定，色谱图见图2。由图2可知，矢车菊素的保留时间为(15.923 0±0.275 8)min。

图2 标准品色谱图Fig.2 Standard chromatogram

2.2.6矢车菊素定量分析。以峰面积为纵坐标(y)，矢车菊色素浓度为横坐标(x)，得到花青素标准曲线(图3)的线性回归方程及相关系数:y= 24.227x+5.390 3，R2=0.999 8。线性范围为2～100 μg/mL，检出限为0.34 μg/mL。

图3 花青素标准曲线Fig.3 The standard curve of Anthocyanin

2.2.7回收率和精密度。矢车菊素的回收率为102.5%，峰面积的RSD=1.07%(n=5)。

2.3卷丹百合珠芽发育过程中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分析由图4可知，卷丹百合珠芽内的矢车菊素含量随着珠芽发育时间的延长，呈双峰递增趋势。从肉眼可见(2 mm)起，生长7 d后其花青素含量达36.08 mg/kg，当珠芽生长到21 d时，含量达140.98 mg/kg，出现第一个“小高峰”；第21天后，珠芽的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量略有下降，第49～91天，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量急剧增加，至91 d时，珠芽内矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量达344.76 mg/kg，且不再增加。因此，珠芽发育至91 d是采集珠芽提取矢车菊素3-O-葡萄糖苷的最佳时间。此时珠芽形态发育基本成熟，每个珠芽平均重量0.048 08 g，每株平均生长29.27粒珠芽，平均每粒珠芽含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷16.576 0 mg/kg，平均每株含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷485.181 3 mg/kg。

图4 卷丹百合珠芽发育进程中矢车菊素-3-O-菊萄糖苷积累量Fig.4 The accumulation of cyanin during bulbet development of Lilium lancifolium

3 结论与讨论

在青海年平均气温5.5～8.0 ℃的地区，卷丹百合露地栽培地上部生长期180～190 d，且休眠鳞茎在-15.0 ℃下能安全越冬。出苗后45～60 d，叶腋珠芽开始形成，发育持续时间约91 d，形成过程大致可以分成“鱼雷期”“胎儿期”和“球形期”3个时期，进入球形期后可作为“种子”或其他用途收获。该试验对Agilent 1260高效液相色谱仪测定卷丹百合珠芽矢车菊素-3-O-葡萄糖苷进行条件优化，优化后的条件与Markakis[8]、叶兴乾等[9]对其他植物矢车菊花色苷元-3-葡萄糖苷的分离测定条件有较大差异。利用优化条件对卷丹百合珠芽不同发育时间的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量进行测定，结果表明，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量随着珠芽发育时间的延长，呈“双峰”递增趋势，这主要与珠芽不同发育阶段的发育中心有关，在第7～21天珠芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量随珠芽体积增大而增加，到第21天，珠芽基本形态已经建成，而珠芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量也出现第一个高峰，第21天后珠芽发育中心开始转入中心芽即生长点的形成，部分已经积累的养分向发育中心转移，导致此阶段珠芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量略有下降，至第41天中心芽形态分化结束，并进入整个珠芽内含物积累与充实阶段，珠芽中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量又快速增加，但91 d达到第2个高峰，这与陈越等[17]对卷丹百合珠芽内多糖、总皂苷、酚类和生物碱含量的变化规律研究结果一致。珠芽生长至91 d基本完成形态成熟，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量不再增加，达344.76 mg/kg，此时是采集珠芽提取花青素的最佳时间。矢车菊素是花青素的重要成分，具有重要的医药价值和保健价值， 同时还具有抗炎症、抗肿瘤[18]等多种生物学活性的功效和具有改善缺铁性贫血、降低血脂、预防动脉粥样硬化、抗疲劳、抑制癌细胞的作

用[19-20]等。卷丹百合珠芽含有较丰富的花青素类各种成分，充分利用生长过程中的副产品，开发与花青素相关的医药和保健产品，对于增加卷丹百合的利用价值和收益具有十分重要的意义。