淋巴细胞主动免疫治疗对反复胚胎种植失败患者的临床效果及T淋巴细胞因子水平变化的影响

陈 慧，刘仲伟，孟昱时△,李东娅，马 兰，杨晓玲

(1.昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，昆明 650101;2.湖南省郴州市第一人民医院生殖中心 423000)

20世纪80年代起，基于胚胎作为有异于母体组织抗原的同种免疫理论，学者提出了淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immunotherapy，LIT)方法，并应用于复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)患者[1]。基于反复胚胎种植失败(repeated implantation failure,RIF)与RSA患者可能存在类似的免疫失衡机制，学者推测不明原因的RIF可能是发生在种植10 d内的免疫排斥以致早期流产而着床失败。尝试性将LIT应用于RIF患者以调节免疫失衡，但其有效性及免疫调节机制在国内外仍存在争议。本文探讨LIT对RIF患者的临床效果及T淋巴细胞因子水平变化的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014-2016年在昆明医科大学第二附属医院生殖医学科接受体外受精与胚胎移植(IVF-ET)助孕的不明原因RIF患者214例为研究对象，按是否接受LIT分为LIT组及对照组。入组标准[2]:胚胎移植大于或等于3次优质胚胎，或累计移植优质胚胎数大于或等于10枚仍未获临床妊娠；排除双方染色体异常，输卵管积水，内分泌紊乱，血栓前状态，子宫内膜异常，多囊卵巢综合征及子宫内膜异位症等可能影响胚胎着床的不利因素[3]。本研究经伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2方法

1.2.1LIT方案 按照李大金等[4]的操作方法，无菌抽取丈夫或健康第三者空腹静脉血30 mL，适量肝素抗凝，在无菌条件下常规分离提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次，调节淋巴细胞浓度达到(20～30)×106/mL；对患者前臂外侧行皮内注射，注射后30 min观察是否出现红肿、水泡等局部反应。每2～3周注射1次，4次为1个疗程。

1.2.2胚胎移植及黄体支持 若有冻存胚胎，在行LIT 1个疗程后行冻融胚胎移植。若无移植冻存胚胎，在LIT期间再次进入IVF-ET周期行超促排卵，在行LIT 1个疗程后行新鲜胚胎移植。胚胎移植后采用黄体酮针剂/黄体酮阴道凝胶(雪诺酮每支90 mg，德国默克公司)、地屈孕酮片(每片10 mg，荷兰苏威公司)或人绒毛膜促性腺激素(HCG) 2 000 U进行黄体支持，持续用药至妊娠8～10周。胚胎移植术后14 d检测尿或者血HCG阳性确定为生化妊娠。胚胎移植术后28～35 d B超检查见孕囊、胚芽及原始心管搏动为临床妊娠。孕12周前发生的自然流产为早期流产。

1.2.3标本收集 2016年5-12月接受LIT患者21例，测定治疗前后T淋巴细胞相关因子水平。患者在LIT治疗前及治疗1个疗程后2周留取样本，于8:00-10:00空腹抽取肘静脉血5 mL，静置15 min，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min,取上层血清，置于-80 ℃冰箱，待测。采用ELISA检测血清样本中白细胞介素(IL)-10、IL-17、γ-干扰素(IFN-γ)、转化生长因子β1(TGF-β1)细胞因子水平，并计算IFN-γ/IL-10和IL-17/TGF-β1比值。按照试剂盒说明书步骤操作。

2 结 果

2.1一般情况 接受LIT患者97例(LIT组)，未行LIT患者117例(对照组)，两组患者一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。另21例检测血清细胞因子水平的RIF患者平均年龄(33.00±4.01)岁，平均BMI(22.46±2.86)kg/m2，平均不孕时间(5.57±3.48)年，平均胚胎移植失败(3.54±1.50)次。

表1 两组患者一般情况比较

2.2临床效果 LIT组患者胚胎种植率、临床妊娠率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，流产率明显低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组患者临床效果比较[n/n(%)]

2.3治疗前后血清细胞因子水平 21例RIF患者LIT治疗后IFN-γ、IL-17水平、IL-17/TGF-β1比值较治疗前下降(P<0.05)；IL-10及TGF-β1水平较治疗前增高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 治疗前后各细胞因子变化

续表3 治疗前后各细胞因子变化

3 讨 论

目前IVF-ET治疗过程中，排除导致胚胎种植失败的诸多可能因素外，如胚胎因素、宫腔因素、易栓症等，仍有部分患者找不到原因，对于这部分患者治疗手段有限，是当今研究的热点和难点。

免疫因素是影响胚胎着床的主要因素之一，正常妊娠过程中只有母体的免疫耐受达到平衡状态才能保护携带半异体抗原的胚胎免受母体的排斥，否则将导致胚胎着床失败或流产。

免疫失衡具体的发病机制仍不明确，研究发现T淋巴细胞免疫应答在胚胎反复种植失败中发挥了重要的作用[5-8]。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和肿瘤坏死因子β(TNF-β)，介导迟发型变态反应(DTH)和巨噬细胞活化等细胞免疫应答、炎性反应和急性排斥反应过程；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，介导体液免疫应答，被认为是免疫调节性因子。有研究认为Th1细胞因子可干扰滋养细胞的侵蚀,并抑制子宫内膜蜕膜化，还可引起NK细胞的活化、浸润,诱发妊娠早期滋养细胞凋亡,导致胚胎死亡[9]。Th2细胞因子作为免疫调节性因子,可以下调Th1的反应,从而诱导母体对胎儿产生免疫耐受。因此，Th1/Th2平衡在胚胎植入过程中起到了非常重要的作用。Th17细胞特征性分泌IL-17，而不产生IFN-γ和IL-4，参与移植排斥等的发生、发展。Treg细胞具有免疫无能和免疫抑制两大功能特征，可分泌IL-9、IL-10及TGF-β等多种抑制性细胞因子。Treg细胞可抑制反应性CD4+T淋巴细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞的活化、增殖与效应功能，能抑制半同种抗原引起的母体对胚胎的免疫排斥反应，在胚胎种植期及妊娠早期维持妊娠免疫耐受起重要作用[10]。

近几年，少数学者将LIT应用于RIF患者的治疗中。有研究[11-13]认为经LIT治疗RIF患者，可以从中获得短期的明显益处。有研究认为LIT能提高RIF患者的活产率，但仅仅针对有异常免疫风险的RIF患者[14]。另有研究认为LIT治疗RIF的适应证有限[15]，并对临床效果持反对态度，认为LIT可改善多次生化妊娠患者的再次生化妊娠现象，但不能改善RIF患者的妊娠结局。

本研究结果显示，LIT组患者的胚胎种植率、临床妊娠率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，流产率低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示LIT可改善RIF患者再次IVF-ET的胚胎种植率和临床妊娠率；两组流产率虽无明显变化，但LIT组的流产率呈现下降趋势。

LIT治疗后IFN-γ、IL-17水平及IL-17/TGF-β1比值较治疗前下降(P<0.05)；IL-10及TGF-β1水平较治疗前增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。说明Th17优势地位下降，Th17/Treg平衡向Treg转化，这与文献[16-17]对LIT的免疫调节机制的研究结论相一致，进一步说明LIT通过下调Th1因子和上调Treg因子的表达,调节母胎免疫耐受从而利于胚胎植入。

综上所述，LIT可以改善RIF患者再次IVF-ET的结局；LIT对Th1细胞因子下调作用更加明显，而对于Th2细胞因子的调节作用不明显。本研究样本量有限，还有待于扩大样本量做进一步研究。