柠檬酸洗脱血小板表面HLA-Ⅰ类抗原的效率和对血小板功能的影响

杨冬梅，程 福，王 洁，杨 倩，杨 莉，黄远帅

(西南医科大学附属医院输血科，四川泸州 646000)

许多患者在输注充足剂量的血小板后，其未见有效地提升，有时甚至下降，临床出血未明显的改善，此为血小板输注无效(platelet transfusion refractoriness,PTR)[1]。PTR的原因基本可归结为非免疫因素和免疫因素[2-4],非免疫因素主要是感染、发烧、脾功能亢进素，免疫因素为患者体内产生抗人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和抗人血小板抗原(human platelet antigen，HPA)的抗体。据相关报道[5]，引起PTR的血小板同种抗体中80%为HLA抗体。针对产生HLA抗体的患者，最佳的方法是输注HLA相合的血小板[5]。但是在实际的临床工作中，常常难以获得和患者HLA相合的血小板。

早在20世纪80年代，不少研究报道柠檬酸可以处理血小板表面HLA-Ⅰ抗原[6-7]。近期又有学者提出[8-10]，pH=3的柠檬酸可以洗脱血小板表面的HLA-Ⅰ抗原，但是关于洗脱效率、对血小板功能的影响及洗脱的条件，不同的研究有所不同。本研究探讨柠檬酸洗脱血小板表面HLA-Ⅰ类抗原的效率和对血小板功能的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 所有的血小板均来自四川省泸州市中心血站。献血者符合国家规定的献血者标准，均为提前1 d准备的新鲜血小板。每次实验前，用血球分析仪进行计数，验证其白细胞残留量、红细胞残留量、血小板数分别达到国家质量标准。其中性别、年龄、血小板计数差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要仪器与试剂 流式细胞分析仪(FACSCANTO Ⅱ,美国BD公司)；722分光光度计(棱光，上海精密科学仪器有限公司制造)；光学显微镜(BX50,日本Olympus公司)；血细胞分析仪(BC-6800，美国Mindray公司)；血小板恒温振荡保存箱(山江电子科技)；血细胞计数池(上海市求精生化试剂仪器有限公司)；藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD62P抗体(批号:555749，美国BD公司)；异硫氰荧光素(FITC)标记的鼠抗人HLA-ABC抗体(批号:555748，美国BD公司)；FITC标记的鼠抗人IgG1同型对照抗体(批号:555742，美国BD公司)，PE标记的鼠抗人IgG1同型对照抗体(批号:555749，美国BD公司)；含1%胎牛血清清蛋白(BSA)的pH=3的柠檬酸缓冲液；PBS缓冲液。

1.3方法

1.3.1柠檬酸缓冲液的配制 pH=3的柠檬酸缓冲液由等体积的0.263 mol/L柠檬酸和0.123 mol/L Na2HPO4配制而成，其中含1% BSA，pH计滴定微调，置于50 mL的无菌容器备用。

1.3.2酸处理血小板 按照析因设计优化试验条件。反应时间3个水平(5、10、15 min)，柠檬酸与标本的体积比(V1∶V2)5个水平(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1),每种组合重复2次。参考文献[8，11]的方法进行了部分改进。取500 μL浓缩血小板悬液(约含5×108个血小板)于试管中，离心 (10 min,1 500 g)，弃上清液，加入一定量的酸溶液，置于冰上0 ℃反应一定的时间。加入过量PBS中止反应，然后立即离心(10 min,1 500 g)洗涤血小板，最后将其重悬于乏血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)。

1.3.3血小板质量与功能的改变 析因设计选择的最佳实验条件处理血小板作为试验组，用PBS代替柠檬酸处理血小板作为对照，未处理为空白对照，进行如下质量与功能的检测。(1)血细胞分析仪上检测各组血小板计数、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)。(2)取处理后的血小板10 μL于牛鲍计数板冲池，观察是否有大血小板及是否有聚集，同时革兰染色镜检。(3)使用722分光光度计，参考血小板聚集仪的检测原理[12]，检测血小板的低渗休克反应(HSR)，记录样本透光率的变化。样本最大透光率记录为TMAX，透光率平衡后的最小样本透光率记录为TMIN；另一测试杯中加入PBS，记录为TPBS。HSR=(TMAX-TMIN)/(TMAX-TPBS)×100%。

1.3.4检测血小板表面HLA-Ⅰ抗原及CD62P抗原 根据前向散射角(FCS) 和侧向散射角(SSC) 确定待检细胞群，确定血小板的检测范围。检测平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)的变化。取血小板100 μL(约含血小板1×106个)置于试管中，加入PE标记的CD62P抗体、FITC标记的HLA-Ⅰ抗体各20 μL，同型对照管加入PE、FITC标记的鼠抗人IgG各20 μL，室温闭光孵育30 min，加入400 μL PBS，上机检测各组血小板表面HLA-Ⅰ抗原和CD62P抗原。

2 结 果

2.1析因设计 反应时间的延长并不会提高HLA-Ⅰ类抗原的洗脱效率(P>0.05)，柠檬酸与血小板体积比为5∶1时才能有效洗脱血小板表面的HLA-Ⅰ类抗原(P<0.05)，见图1。

图1 不同反应条件血小板表面HLA-Ⅰ抗原表达率

2.2血小板常规质量指标 3组血小板数量上的差异无统计学意义(P>0.05)。PBS和酸处理后的血小板MPV、PDW均高于未处理组(P<0.01)，酸处理组变化更明显(P<0.05)，见表1。

表1 各组血小板常规质量指标比较

2.3血小板形态 显微镜下见牛鲍计数板中的各组血小板散在分布，未见明显聚集。酸处理的血小板体积稍有增大，染色稍深，见图2。

A：未处理组；B：PBS处理组；C：酸处理组

图2各组血小板涂片革兰染色

2.4HLA-Ⅰ类抗原及CD62P抗原的表达 与未处理组比较，酸处理组HLA-Ⅰ表达率从(88.86±4.37)%降至(12.44±11.91)%(P<0.01)，而CD62P的表达率从(4.17±3.54)%增至(8.88±5.70)% (P>0.05)，见图3。

A：各组HLA-Ⅰ类抗原表达率；B：各组CD62P的表达率；C：流式细胞图；*：P<0.05

图3 HLA-Ⅰ类抗原及CD62P抗原的表达

2.5血小板HSR 酸处理组HSR(51.65±6.56)%较未处理组(62.05±8.14)%降低(P<0.01)，与PBS处理组(54.95±6.32)%相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 各组血小板HSR情况

3 讨 论

PTR目前仍然是临床上一个严峻的问题，而HLA-Ⅰ类抗原是引起免疫相关的PTR的主要原因[13]。虽然最佳的做法是输注HLA相配合的血小板，但是由于HLA分型成本高且费时[14]，目前还没有建立一个完整的HLA分型库，对HLA-Ⅰ类抗原引起的PTR，研究一种新的方法作为其紧急输血策略，完善临床输血非常重要。本试验一方面评估柠檬酸能否有效处理血小板表面的HLA-Ⅰ类抗原，另一方面通过评估该处理技术是否引起血小板形态及功能的改变，验证该技术的可行性。

按照析因设计的原理和方法，对影响试验结果的各个因素进行多水平重组分析，检测HLA-Ⅰ类抗原表达率的变化，发现反应时间并不会影响血小板表面抗原的表达率，而只有在V1∶V2为5∶1的时候，柠檬酸洗脱血小板表面HLA-Ⅰ类抗原的效率最大。故考虑pH=3，反应时间5 min，反应体积5∶1为最佳试验条件，以此作为试验组的反应条件。

本研究显示柠檬酸能有效洗脱血小板表面的抗原，与近期的研究结果一致[8，15]。CD62P是血小板活化的重要标志物之一，既往研究[11]提示血小板在酸处理后活化明显增高。但在本研究中，血小板CD62P的表达只是稍有增高，推测既往的高活化水平一方面是试验的标本不是新鲜血小板，自身活化偏高，另一方面是酸作用的时间过长及终止反应不彻底。因为HOLME[16]的研究表明，当血小板pH值较低时，血小板的形态和功能将出现不可逆的损伤。

通过对血小板常规指标的分析，发现3组血小板计数的差异无统计学意义，酸处理组和PBS处理组MPV和PDW均高于未处理组(P<0.05)，推测离心、洗涤等一系列操作步骤和柠檬酸的共同作用导致MPV和PDW的改变。镜下观察酸处理的血小板，体积稍有增大，染色较深，但没有聚集现象。MPV和PDW的改变提示血小板质量的下降和存储损伤[17-18]，而血小板形态的改变，可能会缩短血小板体内的循环时间，进而影响血小板的回收率和存活率。

HSR是血小板在低渗环境中体积膨胀之后，再恢复其正常体积的能力，反映血小板的体外功能及质量，是反映血小板回收率和存活率较好的指标[19]。与血小板形态的改变结果一致，酸处理后的HSR低于未处理组(P<0.05)。说明酸处理会影响血小板的质量，但与文献[20]相比较，HSR值不算太低，故考虑酸处理后的血小板仍有应用于临床的价值。

综上所述，酸处理能有效洗脱血小板表面的HLA-Ⅰ类抗原，洗脱率高达80%，血小板活化增加，MPV、PDW稍增高，HSR值降低，所以笔者认为酸洗脱血小板这一技术对血小板质量的影响尚可接受，针对HLA-Ⅰ类抗原引起的PTR，有望将酸洗脱血小板作为其紧急输血的备选方案之一。今后的试验，一方面需要继续优化和改进酸处理这项技术，减少复温、离心、振荡等操作对血小板的损伤，建议操作步骤尽量流畅，不要室外放置过久。另一方面，补充相关试验，完善对血小板聚集、分泌、黏附、释放、代谢功能的研究，全面评价该技术的临床可行性、有效性、切实性，为临床提供切实可靠的依据。