miR-214调控的凋亡在肝纤维化中的作用

刘立朋，张秀利，张秀英*

(1.首都医科大学 人体解剖与组织胚胎学系，北京100069；2.吉林大学中日联谊医院 新民胸外科)

细胞凋亡(apoptosis)对维持机体正常生理功能起到重要作用[1]。有文献揭示Bim可通过其下游蛋白导致线粒体膜上Bax/Bak发生寡聚化[2]，引起线粒体膜的通透性改变，释放细胞色素C(cyt C)，激活凋亡蛋白 Caspases(如Caspase-3)诱导细胞凋亡[3]。同时有文献指出，miR-214 可以抑制骨肉瘤细胞及过氧化氢诱导的心肌细胞的凋亡[4,5]。本研究旨在探讨miR-214调控的凋亡在肝纤维化小鼠中的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1C57BL/6 小鼠(动物许可证号:SCXK2012

0001)于维通利华公司购买，小鼠为雄性，体重18-22 g，6周龄，SPF级，于首都医科大学动物房规范化饲养。

1.1.2主要试剂 H&E试剂盒，天狼猩红试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)； miR-214 agomir negative control，miR-214 agomir由北京欧林格生物科技有限公司合成；RNA 提取试剂Trizol；鼠抗α-SMA单克隆抗体(sigma)；兔抗Caspase-3单克隆抗体(CST)；羊抗兔 IgG-HRP，羊抗鼠 IgG-HRP(CST)；micro-RNA 逆转录试剂盒(Taqman)；PVDF 膜 (Merck Millipore)；ECL发光液(Bio-red)。

1.2 方法

1.2.1肝纤维化动物模型制作 24只6周龄雄性 C57BL/6 小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)，以每组12只随机分为两组。实验组采用四氯化碳腹腔注射诱导肝纤维化，以1∶9的比例将四氯化碳溶于橄榄油中，按体重给予1 mL/kg，每周两次，进行腹腔注射，对照组仅用橄榄油进行腹腔注射。四氯化碳注射6周时，采用尾静脉注射方式，对照组注射 miR-214 agomir negative control ，实验组注射 miR-214 agomir每周注射一次，每次 1 nmol，共注射两周。待造模8周时对小鼠进行取材，部分肝组织放于 10% 福尔马林溶液中用于石蜡包埋进行形态学染色；部分组织存放于-80℃超低温冰箱用于 Western blot；少量组织存放于-20℃冰箱RNlater溶液中用于 Real-time 检测。

1.2.2形态学染色 肝组织放于10%福尔马林液中固定至少48小时后，进行常规脱水、透明和石蜡包埋。以4 μm厚度进行石蜡组织切片，用于HE和天狼猩红染色，光学显微镜下检测其病理程度并照相。

1.2.3Western blot检测α-SMA 和 Caspase 3 的表达 造模6周时取实验组和对照组各 40 mg,加入 650 μl RIPA 蛋白裂解液，冰上充分匀浆裂解，提取总蛋白液。对蛋白液进行变性后，取约30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE 电泳，后以 300 mA 恒流转印至PVDF 膜。5% BSA 室温封闭一小时，第一抗体α-SMA和Caspase 3(均为1∶3 000稀释)于4℃过夜孵育，第二抗体(1∶4 000稀释)室温孵育1小时。使用FUSION FX7曝光仪器(法国VilberLourmat公司 )扫描并采集图像。

1.2.4实时定量PCR 检测(Real-time PCR) 使用Trizol提取细胞或保存于RNlater溶液中的肝脏组织总 RNA，并根据供销商提供方案对总 RNA 进行 DNase I(北京全式金生物技术公司)处理。采用颈环引物将 RNA 逆转为与 miR-214 对应的 DNA，在 ABI 公司 7500 仪器中使用 SYBR Green Master mix 体系进行检测，将相应 CT 值(2-△△ CT)进行统计并分析。实时定量PCR及逆转录所用颈环引物microRNA 引物见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5统计学分析 采用SAS 9.4统计软件进行统计分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组纤维化明显

造模6周时进行取材，H&E及天狼星红染色结果显示(图 1)：HE染色显示对照组未见纤维增生，肝脏组织形态结构正常；而实验组肝脏组织纤维增生, 同时伴随一定的炎性细胞浸润。天狼猩红染色显示实验组纤维增生明显，可见明显染色成红色的纤维间隔。以上实验结果显示，肝纤维化模型造模成功。

A,对照组H&E 染色； B,实验组H&E染色； C,对照组天狼猩红染色；D,实验组天狼猩红染色

2.2 肝纤维化小鼠肝组织内miR-214 表达量显著下降

四氯化碳注射4，6，8周后取材，实时定量 PCR 结果显示与对照组相比，实验组 miR-214 在第4周时上升，但无统计学意义。第6周和8周时表达量显著下降，P<0.01(图 2)。

2.3 miR-214 agomir干预组小鼠纤维化得到改善

Western blot 结果显示miR-214 agomir干预组纤维化标志蛋白α-SMA相较于 miR-214 agomir negative control 组表达量显著下调。同时，我们发现 miR-214 agomir干预组凋亡蛋白Caspase-3 表达显著下调(图 3)。

3 讨论

肝纤维化是一个极其复杂的病理过程，各种病因引起的慢性肝损伤均会导致肝脏进行修复愈合，在此修复过程中会导致肝实质细胞和门静脉区细胞外基质沉积。如果不能及时去除病因阻断肝纤维化进展，则可能进展为不可逆转的肝硬化甚至肝癌等终末期疾病。但是目前尚无临床上证实的有效治疗手段。因此对肝纤维化发病机制进行深入研究，阻断其进一步发生发展，仍然具有重大的临床意义。

图2 实时定量PCR 检测两组小鼠肝组织中miR-214基因表达水平

图3 免疫印迹检测两组小鼠肝组织中α-SMA以及Caspase 3蛋白的表达

大量研究揭示 MicroRNA 在慢性肝病及肝纤维化中发挥重要作用[6]。 miR-214 做为纤维化的调节分子引起了广泛关注[7]，有研究指出在不同器官以及肝纤维化/肝硬化不同阶段，肝组织 miR-214 表达是不同的。有文献报道肝组织 miR-214 高表达促进纤维化[8,9]，同时也有文献指出在纤维化的早期阶段肝组织 miR-214 表达下调[10]。本研究显示在四氯化碳造模4周时，miR-214 表达上调但无统计学差异，这与本课题组前期基因芯片结果相符[11]。但在造模第6周及8周时 miR-214表达显著下调。我们的结果也印证了上述观点，即在肝纤维化不同阶段 miR-214 表达是不同的。这也提示我们，要对 miR-214 在不同纤维化阶段进行更进一步的检测，明确其不同阶段的作用。

有文献指出 miR-214 与细胞凋亡密切相关，例如，miR-214 可通过对下游靶基因AIFM2 或 PTEN 基因调控抑制细胞凋亡[12,13]。更有文献进一步指出，在胰腺癌中Caspase 3 表达升高促进凋亡[14]。我们发现miR-214 agomir干预组小鼠肝脏凋亡蛋白 Caspase 3 以及α-SMA 表达下调。我们推测 miR-214 agomir干预后小鼠肝脏凋亡受到抑制，从而减轻了肝脏炎症反应，抑制了纤维化。然而 miR-214 在肝纤维化不同阶段的调控作用，仍需深入研究，以便为临床肝纤维化治疗提供依据。