白血病患者ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区异常甲基化及mRNA表达的研究

崔桂荣,李 焱,贾振薇，张金华

(邯郸市第一医院 血液内科,河北 邯郸056002)

DNA甲基化(methylation)作为最早发现的修饰途径一直属于生命科学的前沿课题之一，其能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达[1]。研究显示[2]：白血病抑癌基因启动子异常甲基化与白血病的发病机制密切相关，抑癌基因启动子高甲基化抑制相关mRNA的表达水平可能为白血病发病的重要分子机制。本研究采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)及实时荧光定量RT-PCR(RT-QPCR)对ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因启动子区甲基化状态及相关mRNA进行了检测，旨在探讨白血病分子发病机制，为白血病防治提供临床资料。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2016年1月至2018年1月我院血液科就诊的80例初诊未治白血病患者为研究对象，其中男56例，女24例，年龄15-48岁，平均(34.3±11.6)岁，包括：急性髓系白血病(AML)34例、急性淋巴细胞白血病(ALL)25例、慢性粒细胞白血病(CML)21例，白血病诊断及分型符合FAB诊断及标准；选取同期60例志愿者为对照组，男41例，女19例，年龄15-45岁，平均(33.3±10.7)岁，包括缺铁性贫血48例，特发性血小板减少性紫癜12例。两组在性别、年龄构成上无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理会批准通过，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

两组研究对象肝素抗凝取骨髓液2 ml，分离单个核细胞-80℃冻存行基因组提取。MS-PCR检测ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因启动子区状态，DNA/RNA抽提试剂盒购自日本Ta Ka Ra公司产品；PCR引物由Invitrogen公司合成。反应条件,ID4：94℃ 4 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30个循环；72℃延伸7 min；WTl ：94℃ 4 min；94℃ 45 s、58℃30 s、72℃45 s、40个循环；72℃延伸7 min；GLIPRI：94℃ 5 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30个循环；72℃延伸7 min。甲基化特异性引物：ID4-MF：5′-TTTTATAAATATAGTTGCGCGGC-3′；ID4-MR：5′-GAATATCCTAATCACTCCCTTCGA-3′；WTl-MF：5′-TTTGGGTTAAGTT-

AGGCGTCGTCG-3′：WTl-MR：5′-ACACTACTCCTCGTACGACTCCG-3′；GLIPRl-MF：5′-TAAT-

TATATTTTTAGAAATTGCGGC-3′：GLIPRl-MR：

5′-ACTATTAATTTCACCTCTAATCGAA-3′。

RT-PCR检测相关mRNA表达情况，人急性髓系细胞白血病细胞株HL-60及慢性粒细胞白血病细胞株K562购自珠江医院，RT逆转录试剂盒购自宝生物工程有限公司。ID4：上游引物：5′-TCACTGCGCTCA ACACCGACCC-3′；下游引物：5′-TTCCCCCT CCCTCTCTAGTGCTCCTG-3′；WTl：上游引物：5′-GATAACCACACA ACGCCCATC-3′；下游引物：5′-CACACGTCGCACATCCTG AAT-3′；GLIPRI：上游引物：5′-AATAGCCTGGATGGTTTCTT-3′，下游引物：5′-CATAGTCCTGGATTTCGTCA-3′。

反应条件，ID4：94℃ 4 min；94℃ 30 s、60℃30 s、72℃45 s、40个循环；72℃延伸7 min；WTl ：94℃ 4 min；94℃ 45 s、55℃45 s、72℃45 s、30个循环；72℃延伸7 min；GLIPRI：94℃ 5 min；94℃ 30 s、49℃30 s、72℃45 s、30个循环；72℃延伸8 min。

1.3 统计学处理

数据分析采用统计学软件SPSS19.0，白血病患者与对照组构成比、率的比较采用卡方检验，mRNA表达以2-▲Ct表示，均值比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK法分析，以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区甲基化比较

白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区甲基化经卡方检验分析比较均有统计学差异(P<0.05)，与对照组比较白血病患者WT1甲基化程度降低，ID4及GLIPR1基因启动子区甲基化程度增高；AML、ALL及CML患者ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区甲基化经卡方检验分析比较均无统计学差异(P>0.05)。

2.2 白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表达比较

白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表达比较经方差分析均有统计学差异(P<0.05)，组间两两比较经SNK法分析，ID4基因mRNA表达，AML、ALL及CML组间无统计学差异(P>0.05)，均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；WT1、GLIPR1基因mRNA表达四组比较，任意组间均有统计学差异(P<0.05)。

表1 白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区甲基化比较(n，%)

注：与对照组比较*P<0.05，与AML比较#P<0.05，与ALL比较▲P<0.05

表2 白血病患者与对照组ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表达比较(n，%)

注：与对照组比较*P<0.05，与AML比较#P<0.05，与ALL比较▲P<0.05

3 讨论

白血病的分子发病机制一直为血液病研究的热点，诸如DNA甲基化等表观遗传也是当今生命科学研究的前沿领域[3]。作为DNA的天然修饰方式，DNA甲基化为DNA甲基转移酶催化甲基供体将胞嘧啶转变为5甲基胞嘧啶的过程，其参与基因的表达、调控，细胞分化、增生与调节。研究显示[4-6]：异常甲基化与肿瘤的发生密切相关。其中常见的异常甲基化包括抑癌基因启动子CPG岛的异常超甲基化以及DNA广泛的低甲基化。部分学者认为[7,8]：异常甲基化影响基因的表达，可能为白血病发病的重要分子机制。而白血病抑癌基因甲基化谱的研究也为白血病的个性化防治提供了一个全新的思路。本研究着重于探讨ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因启动子区甲基化状态及相关mRNA的表达特点，旨在研究白血病分子发病机制，为白血病防治提供临床资料。

本研究数据显示：AML、ALL及CML甲基化程度均高于对照组，ID4基因mRNA表达也有别于对照组，差异具有统计学意义。动物实验显示[9]：ID4基因为白血病的抑癌基因，定位于人类染色体6p21.3～22，基因所表达的Id蛋白具有高度保守性HLH结构域，为相关基因转录的正性调节转录因子，当ID4基因甲基化程度降低时，Id蛋白可与HLH结构域形成同源二聚体，在转录调控的作用也逆转为负性作用。研究发现[10]：ID4基因与肿瘤血管形成及肿瘤的侵袭有关；在白血病患者中多呈现高度的甲基化[11]。WT1基因最初分离于Wilms瘤细胞，为参与转录的双相调节子，可阻止细胞G0及G1期转入S期，为肿瘤抑制基因。在造血系中可调控造血细胞增殖、分化，参与造血的调控。本研究中AML、ALL及CML患者WT1基因启动子区均呈现低甲基化，相应WT1基因mRNA呈现强表达，WT1基因启动子区甲基化程度与相应mRNA成反比。WT1基因在一定程度上可认为是“泛白血病”基因标志[12]。国外有研究显示[13]：AML、ALL及CML患者WT1基因mRNA表达与病情的进展相关，病情严重患者WT1基因mRNA多呈现强表达；WT1基因mRNA表达临床可应用于AML、ALL及CML病情的监测。GLIPRl基因源于胶质细胞克隆基因，为髓系单核细胞分化标志物，GLIPRl基因启动子区甲基化程度可负性调控相关mRNA的表达，在AML患者GLIPRl基因启动子区甲基化程度最高，高甲基化可导致相关基因的沉默及缺失；在研究中AML患者GLIPRl基因mRNA表达程度最低，有学者认为GLIPRl基因为AML患者甲基化的沉默基因[14]。同时甲基化状态与AML微小残留病密切相关，这为髓系白血病的治疗提供了一个新的方向。抑癌基因甲基化状态的改变以及由此引发的相关mRNA表达异常与白血病的发生、发展关系密切。

综上所述，血液系统恶性肿瘤的发生为一多因素参与的过程，其中抑癌基因甲基化状态的改变及相关mRNA表达异常与之密切相关，肿瘤表观遗传学为血液系统恶性肿瘤的防治提供一个新的方向。