脂联素对2型糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1/Smads信号通路的影响

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糖尿病心肌病(DCM)是一种独立的糖尿病心血管并发症，其主要病理改变为心肌纤维化(MF)，其中转化生长因子-β1(TGF-β1)在MF的发生发展中起重要作用[1-2]。脂联素(ADPN)可能具有心脏保护作用，但机制尚不完全清楚[3]。本研究探讨球型脂联素(gAd)对2型糖尿病(T2DM)大鼠MF中TGF-β1/Smad通路的影响，揭示gAd保护心肌、降低MF的可能机制，为防治DCM提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 体重160～180 g的SPF级健康雄性SD大鼠80只(山西医科大学动物中心)；普通饲料(山西医科大学动物中心)；高脂高糖料(北京科澳协力饲料有限公司提供)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司提供)；gAd(美国BioVision公司提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组 SD大鼠适应性喂养1周，随机分为NC组(n=24)，造模组(n=56)，分别予普通饲料和高脂高糖料喂养。8周后，禁食12 h，造模组给予STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，NC组注射同等剂量缓冲液。72 h后测随机血糖≥16.7 mmol/L，且出现多尿、多饮、多食现象即造模成功，最终造模成功52只。继续喂养6周，将成模大鼠随机分为糖尿病心肌病组(DCM组，n=26)、DA干预组(DA组，n=26)。DA组大鼠每日腹腔注射gAd 10 μg/kg，DCM组和NC组大鼠每日注射同等剂量生理盐水。

1.2.2 心功能测定 大鼠称重，麻醉，超声评价左心室功能，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)。

1.2.3 标本采集 于药物干预4周末、8周末、12周末随机取8只大鼠，麻醉后腹主动脉采血测空腹血糖(FBG)。暴露胸腔，取心脏称重，计算心脏重量指数(HWI)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后吸干水分，取左心室同一部位心肌，部分用10%中性甲醛固定后石蜡包埋切片，HE染色光镜观察心肌组织形态，剩余部分液氮冻透后-80 ℃冻存备用。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌组织Smad3、Smad7、TGF-β1mRNA表达 提取心肌组织RNA，反转录合成cDNA，行RT-PCR扩增：94 ℃预变性10 min，活化Tag酶，94 ℃变性15 s，60 ℃复性60 s，共45个循环。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测心肌组织Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表达 心肌组织50 mg加入0.5 mL裂解液，超声裂解匀浆，4 ℃离心10 min取上清。电泳后转膜，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜，TBST以1∶1 000 稀释兔源TGF-β1、Smad3、Smad7抗体(美国 Cell Signaling 公司)4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL底物化学发光显色、显影、定影、扫描。

2 结 果

2.1 一般指标与心脏超声 各时间段中，与NC组比较，DCM组大鼠FBG升高(P<0.05)，DA组FBG有所下降，但未降至正常水平；DCM组HWI较同期NC组增加(P<0.05)，DA组干预12周后HWI较DCM组下降(P<0.05)；心脏超声显示，与NC组比较，DCM组心功能减退，DA组干预8周、12周后较DCM组心功能改善(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠FBG、HWI和心功能指标比较(±s)

与NC组同时间比较，1)P<0.05；与DCM组同时间比较，2)P<0.05；与同组4周时比较，3)P<0.05；与同组8周时比较，4)P<0.05

2.2 心肌组织HE染色 NC组大鼠心肌细胞形态正常，胞核排列整齐；DCM组细胞大小不一、形态紊乱，呈多形核，细胞间质增多；DA组上述病理改变较DCM组减轻，细胞排列略紊乱。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态学变化(200×)

2.3 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表达水平比较 与同期NC组比较，DCM组心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达增加(P<0.05)，Smad7表达减低(P<0.05)，呈时间依赖性；与同期DCM组比，DA组TGF-β1、Smad3 mRNA表达降低(P<0.05)，Smad7 mRNA表达增加(P<0.05)，呈时间依赖性。详见表3。

2.4 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达水平比较 各时间段，DCM组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3蛋白表达较NC组增加(P<0.05)，Smad7蛋白表达较NC组减少(P<0.05)，呈时间依赖性；而DA组干预后TGF-β1、Smad3蛋白表达较DCM组减少(P<0.05)，Smad7蛋白表达较DCM组增加(P<0.05)，呈时间依赖性。详见图2、表4。

表3 各组大鼠不同时间心肌组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表达水平比较(±s)

与NC组同时间比较，1)P<0.05；与DCM组同时间比较，2)P<0.05

图2 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表达

时间组别 TGF-β1 Smad3 Smad74周NC组0.85±0.010.82±0.021.17±0.02DCM组1.26±0.041)1.09±0.041)0.68±0.011)DA组 0.97±0.021)2) 0.96±0.051)2) 0.72±0.021)2)8周NC组0.88±0.020.64±0.021.06±0.02DCM组1.32±0.021)1.11±0.041)0.63±0.021)DA组 0.92±0.011)2) 0.74±0.011)2) 0.95±0.011)2)12周NC组0.72±0.010.56±0.001.07±0.01DCM组1.33±0.011)1.33±0.021)0.53±0.001)DA组 0.89±0.011)2) 0.66±0.021)2) 1.03±0.011)2)

与NC组比较，1)P<0.05；与DCM组比较，2)P<0.05

3 讨 论

2013年美国心脏病学会基金会/美国心脏协会(ACCF/AHA)心力衰竭指南明确提出DCM概念[4]，其发病机制尚未完全阐明，可能机制包括MF、胰岛素抵抗、细胞异常凋亡、氧化应激、细胞代谢紊乱、线粒体损伤、钙稳态失衡等，其中MF是DCM的特征性表现。

TGF-β1是致纤维化因子，可刺激心脏成纤维细胞增生、胶原合成、心肌细胞肥大、心室重构，与MF密切相关[1]。Smad依赖性信号通路是TGF-β1诱导纤维化经典的信号通路[5]。Smads家族包含3大亚型9种Smad蛋白，分别为膜受体激活型Smad(R-Smad)、通用型Smad(Co-Smad)和抑制型Smad(I-Smad)。Smad3为R-Smad的一种，TGF-β与其胞膜受体结合后，Smad3磷酸化，进而与Smad4(Co-Smad)形成复合物进入核内调节靶基因转录[6-7]。除经典的Smad3/4通路，TGF-β亦可通过非经典的转化生长因子β激活激酶1(TAK1)/p38/氨基末端激酶(JNK)和NADPH氧化酶4(NOX4)/活性氧(ROS)通路，导致胶原基因表达[8]。Smad7为I-Smad，可竞争性抑制R-Smad与受体结合，是TGF-β信号通路的抑制因子。

本实验结果显示，与同期NC组比较，超声显示DCM组大鼠LVEDD、EF、FS减小，而LVESD增大，且呈时间依赖性，同时HWI随病程逐渐增加。表明随着病程进展，DCM逐渐加重，发生心室重构，心功能逐渐恶化。与同期NC组比较，DCM组心肌组织TGF-β1、Smad3表达增加，Smad7表达减低，呈时间依赖性，提示DCM大鼠MF与TGF-β1/Smads通路激活有关。

ADPN是主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子，与胶原蛋白和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结构相似，其中gAd是ADPN实现生物效应的主要区域[9]。ADPN具有增加胰岛素敏感性、抗炎及血管保护作用[10]。多个研究表明ADPN具有心脏保护作用，ADPN可增强小鼠心脏成纤维细胞过氧化物酶体增殖剂激活受体-α(PPAR-α)活性，改善MF[11]。ADPN抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的核因子-κB(NF-κB)的表达，减少炎症因子表达，通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路促进活化的巨噬细胞自噬，减轻炎症反应和MF[12]。本课题组前期研究发现，ADPN可抑制离体培养的心肌细胞TGF-β1/Smads通路的激活[13]。本实验外源性给予DCM大鼠gAd后心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达较同期DCM组均明显减少，Smad7 mRNA及蛋白表达明显增加，且呈时间依赖性；此外，gAd干预12周后心功能改善，HWI较DCM组下降，说明gAd作用具有时间依赖性。以上结果表明gAd通过抑制心肌组织TGF-β1/Smads信号通路改善DCM，且具有时间依赖性。

综上所述，gAd通过影响TGF-β1/Smads通路改善DCM大鼠MF进展，改善血浆gAd水平可能成为DCM治疗的有效手段。