补肾和脉方对自发性高血压大鼠肠道微生物组的影响

2019-03-27，，，，，

中西医结合心脑血管病杂志 2019年4期

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有研究证实，肠道微生物的组成和数量改变与高血压的发生发展具有明确的相关性[1-4]。经16SV4区扩增子HiSeq2500 PE250测序，老龄自发性高血压大鼠(SHR)肠道微生物物种类型降低，厚壁菌和拟杆菌比率增加等[5]。已有部分研究机构有关于调节肠道微生物组调节高血压、糖尿病等代谢相关性疾病报道[6-10]，但各种药物对肠道微生物组影响不明确，调控肠道微生物组有望成为高血压等心血管疾病的潜在治疗靶点。中药对肠道微生物组的影响近年备受关注。补肾和脉方对眩晕病(原发性高血压)的治疗疗效显著[11-14]，对老年单纯收缩期高血压效果尤其显著，可明显改善降压过程因脉压过大造成的组织器官低灌注损伤[15-17]。但作为中药复方，其药理机制作用靶点尚不明确。本研究观察补肾和脉方对自发性高血压大鼠肠道微生物组的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 9月龄雄性SPF级SHR 13只，由北京维通利华实验动物中心提供[许可证号：SCXK(京)2012-0001]，SHR初始血压均已到达高血压平台期，体质量250～300 g。所有动物均于正式实验前适应性测压训练2周(观察适应期)，即每日进行3次测压，8～10 d后大鼠适应测压环境，测压时保持安静；第2周末测量大鼠血压及体质量，记为基础血压及基础体质量。待大鼠适应环境后，每周监测体质量、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)、脉压(PP)。

补肾和脉颗粒(鲁药制字Z20120014)组方：黄芪、黄精、桑寄生、女贞子、牛膝等11味按比例配伍，每包3 g，由山东中医药大学附属医院药房提供，以蒸馏水稀释成含生药2.5 g/mL的混悬药液。

MRBP10通道大小鼠尾动脉血压监测仪，美国IITC公司产品；ME235P电子分析天平，德国赛多利斯产品；梅特勒-托利多DELTA320型pH计，瑞士梅特勒—托利多公司产品；Cascada I超纯水系统，美国PALL公司；5424R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及干预将SHR大鼠随机分为补肾和脉方组(6只)和SHR模型组(7只)，补肾和脉方组每日灌胃给药补肾和脉颗粒混悬液1 mL/100 g体质量(含生药2.5 g/mL)；SHR模型组每日给予等量生理盐水。各组动物于每晚19:00灌胃给药1次，每周用药6 d，连续8周。每周将大鼠装入测量盒内，以电子天平测量体质量，精确到0.2 g，根据变化随时调整给药量。

1.2.2 血压测量方法采用大鼠尾动脉加压法，测量时尾部加温至32 ℃，波形稳定后，测量SBP、DBP、MAP、PP。固定在每周五、周六、周日14:30～17:30连续测压(当日灌胃之前)，由固定专人按照同样测量顺序，每日重复测量3次血压，每次间隔1 min。连续3 d测量血压基础上，取第2天和第3天平均值作为所在周的血压值。实验开始给药前一天，测量3次血压，取平均值作为用药前基础数值。第1次给药当天记作第0天，次日记作第1天，以此类推；连续给药的实验数据均为给药24 h及其之后血压值。

1.2.3 肠道微生物组分析取末次用药24 h后大鼠应激粪便为粪便样品置于无菌离心管中，置于-80 ℃保存。大鼠粪便样品DNA提取和16S V4区扩增子信息采集与分析，委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行(合同编号：V01C101SC17020776)。根据所扩增的16S区域特点，基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库进行双末端测序。通过对读数(Reads)拼接过滤，操作分数单位(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚类，并进行物种注释及丰度分析，揭示样品物种构成；进一步的α多样性分析(Alpha diversity)、β多样性分析(Beta diversity)挖掘样品之间的差异。

2 结果

2.1 两组血压比较灌胃给药8周后，与SHR模型组比较，补肾和脉方组SBP、DBP、MAP、PP均明显下降(P<0.05)。详见表1。

表1 两组血压比较(±s) mmHg

与SHR模型组比较，1)P<0.05

2.2 对大鼠肠道微生物组的影响

2.2.1 OTU聚类通过OTU聚类可见，用药后补肾和脉方组与SHR组样品物种构成存在明显差异。详见图1～图3。

图1 SHR属(Genus)水平上的优势物种相对丰度的GraPhlAn图

图2 补肾和脉方属(Genus)水平上的优势物种相对丰度GraPhlAn图

图3 物种丰度聚类热图(heatmap)

2.2.2 α多样性分析通过7种不同的Alpha多样性指数的计算结果对样品内物种丰度和均一性进行评估。各项指数均表明，用药后补肾和脉方组肠道微生物组多样性与SHR组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。补肾和脉方组物种累积箱形图位置表现为急剧上升，提示群落中有大量物种被发现。详见图4。

表2 α多样性分析指数统计

与SHR模型组比较，1)P<0.05

图4 物种累积箱形图

2.2.3 β多样性分析主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、无度量多维标定法(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)统计结果均说明：补肾和脉方组与SHR模型组样品距离远，群落差异大。详见图5～图7。

2.2.4 厚壁菌与拟杆菌比率厚壁菌门(F)和拟杆菌门(B)比例称为F/B比率，可作为评估病理状态的生物标志物。有研究发现，SHR大鼠F/B比率是WK大鼠的5倍左右，且使用米诺环素治疗能显著降低F/B值，使高血压状态得到改善[18-19]。本实验根据门水平物种相对丰度计算得知，与SHR模型组相比，补肾和脉方组厚壁菌与拟杆菌比率明显降低。详见图8。

2.2.5 共发生网络图(network)分析各个微生物群落之间的关系见图9。

3 讨论

补肾和脉方中黄芪、桑寄生等益精填髓、补肾通络，共为君药；臣以黄精、女贞子等药滋补肝肾；佐以牛膝等药引血通络。诸药合用，共奏补肾气、和血脉之功。整体观念是中医学理论体系的主要特点之一，其中强调人与自然环境的统一性，人体作为一个有机整体，生成并存在于自然界这一大的生态系统中。正如《素问·宝命全形论》曰：“夫人生于地，悬命于天，天地合气，命之曰人”“人以天地之气生，四时之法成”。人体生命过程受到大自然的规定和影响，自然环境的各种变化对人体的生理、病理以及疾病防治都会产生直接或间接的影响。此《灵枢·邪客》之所谓：“人与天地相应也。”随着微生态学和现代医学的发展，逐渐认识到自然界中的细菌等微生物广泛存在于人体内部，特别是肠道中，肠道微生物组已形成一种存在于人体内部的微生态系统。并且发现肠道微生物组的平衡与宿主的健康和疾病之间有密切关系，肠道微生态系统的失衡引起包括高血压、糖尿病、肿瘤、卒中等各种疾病。因此，将这看作是人与自然相统一的另一种表现形式，人体受到外部大生态系统的影响，同样会受到内部微生态系统的影响。因此，有学者提出肠道微生物组可能是中药治疗疾病的潜在靶点。有研究指出，肠道微生物组失调与高血压危险因素有关，如胆固醇、动脉硬化与肠道微生物组，糖尿病与肠道微生物组，肥胖、代谢综合征与肠道微生物组，肠道微生物组可能为高血压发病的环境因素[20]。已有大量研究证实，中药复方制剂可分别从健脾、补益、清热、化湿、泻下、消食、理气等方面直接或间接地对肠道微生态起到不同程度的调节作用,改善肠道微生物组失调，较好地保护肠道微生态的平衡[21]。本研究观察发现，补肾和脉方不仅能降低SHR血压，而且对SHR肠道微生物组有明显改善作用。补肾和脉方显著降低F/B比率，F/B比率是已知公认评估高血压病理状态的生物标志物[6]，F/B比率降低可能是SHR大鼠血压和全身状况改善的机制之一，因此，推测对肠道微生物组的调节是补肾和脉方的药理作用靶点之一。这为研究补肾和脉方及其他中药方剂、中成药制剂的降压机制提供了新思路。肠道微生物组与高血压关系的研究尚且处于初始阶段，面临较多的困难与挑战，一方面研究方法不足；另一方面，肠道微生物组与人体关系复杂，研究其与高血压作用关系时混杂因素太多，如饮食、运动、其他药物、心理因素等。除改善F/B比率外，本研究发现用药后SHR肠道微生物组存在其他多角度、多方向变化，但其具体原因与对高血压的影响尚须进一步研究进行探讨，这也将是下一步的重点研究方向。本研究结果进一步揭示中药复方与肠道微生物组及高血压之间的作用关系，有助于加快中药现代化进程，对临床中药及中西药合用治疗有一定的指导意义。