斛芪提取物对小鼠免疫功能影响的研究

刘翠翠，郭东龙，王景雪

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是临床常用的肿瘤化疗药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，可以抑制人体的体液免疫和细胞免疫，造成机体免疫功能的下降，不利于肿瘤病人的医治和术后恢复。铁皮石斛（Dendrobium officinale）是我国传统的名贵药用植物，被列为“九大仙草”之首，素有“药中黄金”之称，传统中医认为，铁皮石斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效，被录入2010版药典[1]。现代医学研究证明，铁皮石斛富含石斛多糖，有抗疲劳、抗氧化、抗衰老增强机体免疫力抗肿瘤等药理作用，铁皮石斛体外能促进脾细胞增殖，增加单核-巨噬细胞吞噬功能和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）活性，明显增强小鼠免疫功能。许多研究证明，植物多糖可以参与机体多种生理代谢过程，具有调节机体免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老、抗氧化等多种生物活性[2-3]。宋燕华等[4]研究了铁皮石斛叶对二代繁殖雌性大鼠免疫水平的影响。发现铁皮石斛叶能提高动物NK细胞活性，增强细胞免疫功能。程东等的实验也有类似结果[5]。宋美芳等研究了齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖对小鼠免疫功能的影响，发现两者均能促进脾淋巴细胞中γ－干扰素和白细胞介素－2的分泌、增加小鼠足跖肿胀度和脾脏指数[6]。李光等研究了4种不同种属的石斛多糖对小鼠免疫功能的调节作用，其中铁皮石斛多糖和齿瓣石斛多糖效果较好[7]。众多研究表明石斛确有提高免疫功能的作用。斛芪提取物选用铁皮石斛、黄芪等名贵中药材，设计最优比例混合制成复方粉。其中黄芪也是一味名贵中药，黄芪中含有黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮类化合物等68种有效化学成分。现代医学发现黄芪具有增强机体免疫功能的作用[8]。赵晓峰等[9]研究显示黄芪对免疫功能低下的小鼠体液免疫功能和巨噬细胞吞噬功能具有增强作用。杨伟等[10]研究显示黄芪多糖对免疫缺损小鼠的胸腺细胞具有保护作用，可降低其受损后的凋亡，从而改善胸腺功能，提高免疫力。本研究旨在研究以铁皮石斛、黄芪、百合等七味中药组成的斛芪提取物对小鼠免疫功能的影响，为进一步开发针对化疗病人术后恢复、提高免疫力的辅助性功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物

纯系ICR雄性老鼠：体质量18 g～22 g，购于山西医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（晋）2015—0001，使用许可证号：SYXK（晋）2015—0001。所有实验动物均饲养于（25±2）℃的恒温恒湿室内。

1.1.2 药品与试剂

斛芪提取物：由生命科学学院实验室制备，按照现代科学技术优化比例将铁皮石斛与黄芪、百合等中药材制成复合粉。称取50 g斛芪复合粉溶于1 000 mL蒸馏水中，搅拌均匀，置于40℃水浴超声提取30 min，取上清液，6 000 r/min离心5 min，取上清液使用旋转蒸发仪浓缩，温度控制在60℃，浓缩至100 mL，所得斛芪提取物置于4℃保存备用。

环磷酰胺：西亚试剂公司；印度墨水：北京博奥拓达有限公司；0.1%Na2CO3；Hematoxylin-Eosin/HE 试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time） 试剂盒、RNAiso Plus：TaKaRa；异丙醇、氯仿：分析纯，天津市风船化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DK-8D恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；FA224电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌：上海博讯实业有限公司；TU1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；3K15型高速离心机：德国Sigma；9600Real-time PCR反应系统、LineGene9600 Plus荧光定量PCR仪：杭州博日科技有限公司；ACS-计价电子秤：武义大河电子有限公司；OLYMPUS BX53正置荧光显微镜：上海普赫光电科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建模与分组方式

取清洁级ICR小鼠60只，适应性喂养1周。1周后按体重随机分成5组，每组12只，分为模型组、正常对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组。

建模方式为除了正常对照组外，全部小鼠连续3 d腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，构建免疫抑制小鼠模型[11-13]。

建模成功后，各组每天按照高剂量组2 000 mg/kg；中剂量组1 000 mg/kg；低剂量组500 mg/kg的剂量灌胃，从建模后的第1天起，各实验组按照设计的剂量灌胃，连续灌胃30 d，同期正常对照组和模型组分别灌胃0.2 mL/d生理盐水。

1.3.2 单核-巨噬细胞功能测定——小鼠碳粒廓清实验

给药30 d后，按10 mL/kg计算，于尾部静脉注射稀释后的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。于2、10 min眼眦静脉丛取血，立即溶于0.1%Na2CO3溶液中吸打混匀，使用紫外可见分光光度计在600 nm波长下测定吸光值。隔天颈椎脱臼处死后，解剖小鼠，取肝脏和脾脏并称重，计算廓清指数K和吞噬指数α[14-15]。称重后置于-80℃备用。

式中：A2为2 min溶液吸光值；A10为10 min溶液吸光值；t2为计时10 min；t1为计时 2 min。

式中：K为廓清指数[16]。

1.3.3 胸腺指数、脾脏指数测定

小鼠处死后，取胸腺及脾脏，称重，计算胸腺指数、脾脏指数。胸腺指数/%= 胸腺质量（mg）/体重（g）×100脾脏指数/%= 脾脏质量（mg）/体重（g）×100 1.3.4 胸腺、脾脏组织切片制作及染色

将称重后的胸腺、脾脏各剪取1 cm3迅速投于4%的多聚甲醛中固定后制作石蜡切片，制作过程如下：取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片与烤片→脱蜡与醇化→染色→脱水、透明与封片，以便苏木素—伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。常规染色步骤：（1）二甲苯（Ⅰ）15 min；（2）二甲苯（Ⅱ）15 min；（3）二甲苯：无水乙醇=1∶1（体积比），2 min；（4）100%乙醇（Ⅰ）5min；（5）100%乙醇（Ⅱ）5 min；（6）80%乙醇 5min；（7）蒸馏水 5 min；（8）苏木精液染色5 min；（9）水洗 10 min 或流水冲洗 5 min；（10）1%盐酸乙醇 30 s；（11）水洗 30 s；（12）蒸馏水过洗 5 s；（13）0.5%伊红液染色1 min～3 min；（14）蒸馏水稍洗 30 s；（15）80%乙醇稍洗 30 s；（16）95%乙醇（Ⅰ）1 min；（17）95%乙醇（Ⅰ）1 min；（18）无水乙醇（Ⅰ）3 min；（19）无水乙醇（Ⅱ）3 min；（20）二甲苯（Ⅰ）3 min；（21）二甲苯（Ⅱ）3 min；（22）中性树胶封固，进行HE染色观察[17]。

1.3.5 反转录实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR，QRT-PCR）验证小鼠免疫相关基因

取小鼠肝脏脾脏用Trizol法提取肠组织RNA，以琼脂糖凝胶电泳检测并测定其波长260 nm和280 nm处的光密度值，计算OD260nm/OD280nm比值，分析纯度。

在GenBank中查找出各基因的序列，使用Primer 5.0软件对各差异表达基因进行跨内含子设计引物，见表1，实验利用GAPDH作为内参基因，消除本底模板差异。

表1 待测基因QRT-PCR引物的碱基序列、解链温度值Table 1 Base sequences and Tm of specific oligonucleotide primers for QRT-PCR

反转录实时荧光定量PCR使用9600Real-time PCR反应系统，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒。总反应体系为 20 μL，包括 10 μL SYBR GreenⅠ，3.4 μL 去 RNA 酶水，各 0.8 μL 的引物，5 μL cDNA模板。qRT-PCR反应条件为95℃预变性 10 min，随后 95℃变性 10 s，55℃退火 15 s，60℃延伸10 s，72℃终延伸20 s，50个循环。各反应重复3次。荧光定量PCR数据的分析采用2-△△CT法[18]。

1.3.6 统计学分析方法

2 结果

2.1 斛芪提取物对小鼠体重的影响

按照1.3.1的方法灌胃小鼠30 d后，统计小鼠体质量，结果见图1。

图1 各组小鼠灌胃30 d后平均体质量Fig.1 Average body mass after 30 days of intragastric administration in each group of ICR mice

由图1可见，模型组及高、中、低剂量组小鼠体质量明显低于正常对照组，中、低剂量组略高于模型组，说明斛芪提取物对由于免疫低下造成的小鼠体质量减少有一定的缓解作用，且与剂量有关。

2.2 斛芪提取物对小鼠碳粒廓清能力的影响

按1.3.2的方法，测定了模型组、正常对照组和不同剂量组的碳粒廓清指数和吞噬指数，结果见表2。

表2 斛芪提取物对小鼠碳粒廓清能力的影响（±s，n=8）Table 2 Effect of Huqi extractive on carbon particle clearance ability of mice（±s，n=8）

表2 斛芪提取物对小鼠碳粒廓清能力的影响（±s，n=8）Table 2 Effect of Huqi extractive on carbon particle clearance ability of mice（±s，n=8）

注：与正常组相比：*p＜0.05，差异显著，**p ＜0.01，差异极显著；与模型组相比：##p＜0.01，差异极显著；-表示正常对照组和模型组分别灌胃0.2 mL/d生理盐水。

组别剂量/（mg/kg）廓清指数吞噬指数模型组 - 0.004 5±0.00 35** 2.318 3±0.780 9**高剂量组 2 000 0.026 1±0.013 9## 5.206 9±1.666 2##中剂量组 1 000 0.016 3±0.00 79* 4.568 5±0.704 9##低剂量组 500 0.012 3±0.010 6** 3.539 7±0.564 4**正常对照组 - 0.029 2±0.015 3## 5.752 2±1.537 5##

模型组的廓清指数、吞噬指数均显著小于正常对照组（p＜0.01），与模型组相比，3个实验组的廓清指数均高于模型组。且模型组与高剂量组有极显著性差异（p＜0.01）。从吞噬指数来看，与模型组相比，3个实验组吞噬指数显著增高，且高、中剂量组具有统计学意义（p＜0.01），说明斛芪提取物具有增强小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。

2.3 斛芪提取物对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

斛芪提取物饲喂免疫低下小鼠30 d后，分别称取各组小鼠的胸腺和脾脏以及体质量，计算出脏器指数，结果见表3。

表3 斛芪提取物对小鼠胸腺和脾脏指数的影响（±s，n=8）Table 3 Effect of Huqi extractive on thymus and spleen index in mice（±s，n=8）

表3 斛芪提取物对小鼠胸腺和脾脏指数的影响（±s，n=8）Table 3 Effect of Huqi extractive on thymus and spleen index in mice（±s，n=8）

注：与正常组相比：**p＜0.01，差异极显著；与模型组相比：#p＜0.05，差异显著，##p＜0.01，差异极显著；-表示正常对照组和模型组分别灌胃0.2 mL/d生理盐水。

组别剂量/（mg/kg）胸腺指数脾脏指数模型组 - 1.664 3±0.828 8 4.326 8±1.467 0高剂量组 2 000 2.870 1±0.6146**## 6.896 6±1.0468**##中剂量组 1 000 2.613 9±0.696 7**## 5.555 1±0.854 3#低剂量组 500 2.466 9±0.746 9**# 5.249 2±1.319 7正常对照组 - 1.755 6±0.352 3 5.064 8±1.180 8

模型组胸腺指数低于正常对照组，3个实验组与正常对照组相比差异都具有极显著性（p＜0.01），与模型组相比高、中剂量组差异具有极显著性（p＜0.01），低剂量组有显著性差异（p＜0.05）。模型组的脾脏指数低于正常对照组，说明环磷酰胺能使小鼠免疫功能受到抑制，免疫抑制模型构建成功。其中高剂量组与模型组和正常对照组相比都具有极显著性（p＜0.01），表明斛芪提取物具有促进小鼠免疫器官发育的作用，有助于提高小鼠的免疫力。

2.4 斛芪提取物对小鼠免疫器官的影响

2.4.1 胸腺观察

各组小鼠胸腺病理观察图见图2。

模型组小鼠胸腺皮质薄于正常对照组，淋巴细胞大量减少。高、中剂量组小鼠胸腺胸小叶分明，皮质淋巴细胞密集，着色深。网状细胞清晰，胸腺组织与正常对照组接近。说明斛芪提取物可以增加淋巴细胞的发育。低剂量组小鼠胸腺淋巴细胞分布较稀疏，与模型组相近。说明斛芪提取物对由于免疫低下造成的胸腺淋巴细胞减少有修复作用，且有剂量效应。说明斛芪提取物对环磷酰胺致免疫低下的小鼠胸腺损伤有修复作用。

图2 各组小鼠胸腺病理观察图（HE×10）Fig.2 Pathological observation of thymus in each group of mice（HE × 10）

2.4.2 脾脏观察

各组小鼠脾脏病理观察图见图3。

图3 各组小鼠脾脏病理观察图（HE×10）Fig.3 Pathological observation of spleen in each group of mice（HE × 10）

模型组小鼠脾组织显著小于正常对照组。高剂量组小鼠脾组织中央动脉周围淋巴细胞分布密集，着色深，单核细胞存在，脾索、血窦分明；中剂量组小鼠脾组织红髓区变窄；低剂量组小鼠脾组织中央动脉周围淋巴细胞分散；各组小鼠脾组织未发现有明显损伤[19]，说明斛芪提取物对环磷酰胺致免疫低下的小鼠脾脏发育有促进作用，从而提高小鼠免疫力。

综上所述，斛芪提取物对CTX处理的小鼠的体重有改善作用以及肝损伤有修复效果，同时对小鼠非特异性免疫功能有调节作用，且有剂量效应。

2.5 与免疫相关基因CCL2的表达量

其中高剂量组CCL2基因相比正常组呈现上调表达，当与模型组相比较时，高、中、低剂量组基因量均上调，且差异显著（p＜0.05）。

图4 CCL2基因的相对表达量Fig.4 Relative expression of CCL2 gene

3 结论与讨论

免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官，小鼠中最重要的免疫器官为胸腺、脾脏。免疫器官的发育状况会直接影响到机体的免疫力[20]。单核巨噬细胞系统是高等动物和人的非特异性免疫系统之一，其功能主要表现为对颗粒性物质如外来的病毒、细菌等病原体进行吞噬、消化和清除，并分泌各种细胞因子。碳粒廓清实验就是利用单核巨噬细胞系统吞噬、清除碳粒（颗粒性物质）以检测该系统对颗粒性物质的吞噬、清除功能[7]。

趋化因子是一类能够趋化细胞的迁移的小分子分泌蛋白，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙，有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化。CCL2是趋化因子CC亚家族中的一员，能够趋化和激活T淋巴细胞和单核细胞，使免疫细胞向病变部位聚集[21]，从而起到免疫调控作用。也有报道称，CCL2可以通过抑制单核细胞，同时刺激IL-4的分泌，进而抑制肿瘤免疫[22]。有研究表明IL-18和CCL2 mRNA水平的提高都会伴随着蛋白表达的提高，而且这些基因的表达也可以直接表明对DCs等免疫细胞具有影响。因此可以根据mRNA水平的变化间接反映蛋白水平的变化以及胞外多糖对相关免疫细胞的调节作用[23-24]。

本实验从非特异性免疫功能角度研究了斛芪提取物对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影响。结果表明，环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下在灌胃30 d斛芪提取物后得到了矫正。与模型组相比，高、中剂量组吞噬指数明显增加，免疫器官指数也有提高，各项测定结果与模型组相比，均具有显著性差异，说明斛芪提取物对小鼠免疫功能有明显的增强功效，且具有剂量效应。从碳粒廓清能力和免疫器官切片以及免疫相关基因表达等方面研究斛芪提取物对小鼠免疫功能的影响，表明斛芪提取物可以明显提高小鼠免疫力。