鲜槟榔3种不同食用方式对小鼠免疫功能的影响

吴忠坤，赵紫薇，王远亮，3，*李宗军，3，*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128）

槟榔（Areca catechu L.），棕榈科热带常绿乔木，是一种可食用的干燥成熟种子[1]。形状椭圆，含有多种营养元素及药理活性成分，其主要有效成分包括生物碱、酚类、油脂、多种氨基酸及矿物质[2]，其中槟榔碱、槟榔多酚等有效成分均可与水任何比例混溶。槟榔生长区域主要分布在东南亚和南亚地区，并且我国福建、海南、台湾等地均有大面积的种植。2017年我国槟榔产业总产值超过150亿，较上年增长25%左右。槟榔具有较高的药用价值，有杀虫消积、降气、行水、截疟等功效。并且入药历史悠久，在中药中常作为驱虫、消积药物来使用[3]。与此同时，咀嚼槟榔是一种古老的习俗，在亚、非、欧洲的许多国家及北美地区都很常见。槟榔被列为第四大最常用的精神活性物质，需求量仅次于咖啡因、尼古丁和酒精[4]。其常见主要食用方式分为：鲜槟榔、鲜槟榔+蒌叶、鲜槟榔+蒌叶+烟丝3种。2003年国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）正式认定槟榔为一级致癌物[5]。至此，槟榔的食用性安全受到广泛的关注。与此同时国内外学者对槟榔生物碱的药理、毒副作用机制等方面做出了大量的研究，主要集中在槟榔生物碱对口腔、生殖细胞毒性、肝脏毒性以及免疫抑制毒性这些方面[6-10]。然而，鲜槟榔整体食用及其食用方式方面的研究较少。本文探究不同鲜槟榔食用方式对小鼠免疫功能的影响，通过3种常见鲜槟榔食用方式的水提物对小鼠进行灌胃饲养，初步的探究其不同食用方式之间的差异，并为鲜槟榔的食用安全性提出参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 槟榔、蒌叶和烟丝等材料的制备

鲜槟榔：海南省万宁市。槟榔水提物制备：鲜槟榔洗净晾干后切碎，冷冻干燥36 h。冻干后的槟榔块用万能粉碎机粉碎。槟榔粉按质量1∶10的比例水提，水提过程中先超声30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min离心10 min取上清液浓缩。

蒌叶：海南省万宁市。蒌叶水提物制备：选取大小一致的蒌叶洗净晾干，按一颗鲜槟榔两片蒌叶比例选取所需蒌叶。60℃恒温热风干燥4 h。干燥后的蒌叶用万能粉碎机粉碎。蒌叶粉按质量1∶10的比例水提，水提过程中先超声30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min离心10 min取上清液浓缩。

烟丝：长沙市烟草研究所。烟丝水提物制备：按照鲜槟榔重量的10%选取所需的烟丝，60℃恒温热风干燥2 h。干燥后的烟丝用万能粉碎机粉碎，烟丝按质量1∶10的比例水提，水提过程中先超声30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min离心10 min取上清液浓缩。

1.1.2 试验仪器

一斤摇摆式高速万能粉碎机（QE-500克）：浙江屹立工贸有限公司；离心机（LXJ-IIB）：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅（DZKW-S-8）：北京市永光明医学仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（WGL-125B）：天津市泰斯特仪器有限公司；冷冻干燥仪（FD-IA-50）：北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验动物

KM小鼠：由湖南斯莱克景达试验动物有限公司提供，小鼠生产证号为SCXK（湘）2013-0004。本次试验过程中遵循《实验动物管理条例》进行试验研究。

1.3 试验设计

引进40只健康4周龄的SPF级雄性KM小鼠，置于湖南农业大学动物科学技术学院试验动物房灌胃饲养。饲养环境：温度（22±4）℃、相对湿度：50%～70%、光照时长为12 h，进行为期1周的环境适应饲养，并在期间观察其综合情况。环境适应饲养过后随机将小鼠分为4个组，每组10只。每只体重在（19±2）g之间。各组均采用灌胃给药，每天定时灌胃1次，相同环境下饲养4周。4个试验组分别是：

鲜槟榔组：鲜槟榔水提物给药量为0.1mL/（10g·d）。相当于70 kg成人每天食用4个鲜槟榔。

蒌叶组：槟榔蒌叶混合水提物给药量为0.1 mL/（10 g·d）。相当于70 kg成人每天食用4颗鲜槟榔、8片蒌叶。

烟丝组：选取10只体重在（19±2）g的雄性小鼠作为烟丝试验组，采用灌胃法给药，槟榔烟丝混合水提物给药量为0.1 mL/（10 g·d）。相当于70 kg成人每天食用4颗鲜槟榔、8片蒌叶、12 g烟丝。

对照组：纯水给药量为0.1 mL/（10 g·d）。

1.4 结果测定

1.4.1 小鼠体重

试验期间，第一次灌胃前称重并记录其初始体重，后在每次灌胃前称重记录，并观察记录存活现状。

1.4.2 血液指标

灌胃饲养28 d后，禁食12 h，采用眼球摘除法取小鼠血液于EDTA-K2抗凝管中，混匀后12 h内送检。

1.4.3 脏器指数

灌胃饲养28 d后，禁食12 h，先称量其体重，后脱颈处死，取其肝脏和脾脏。取出的肝脏和脾脏用试纸吸取表面水分后称重记录。

1.4.4 免疫球蛋白以及细胞因子

灌胃饲养28 d后，禁食12 h，采用眼球摘除法取小鼠血液于灭菌离心管中，静止后送检。

1.5 数据处理

本次试验使用SSPS21.0软件进行差异统计分析，采用Duncan检验方法检验其显著性，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 对小鼠体重的影响

3种不同食用方式对小鼠体重的影响见表1。

表1 3种不同食用方式对小鼠体重的影响Table 1 Effect of three different eating modes on body weight of mice

由表1可知，在灌胃饲养一周后，可以明显的看出鲜槟榔组的小鼠体重是显著低于对照组的，在灌胃后的第二周，鲜槟榔组小鼠的体重与蒌叶组和烟丝组也呈现出显著性的降低（p＜0.05），与对照组差异更是明显（p＜0.01或p＜0.05）。后两周虽在增长但其趋势不明显，仍然与对照显著性降低。蒌叶组的小鼠在灌胃饲养一周后也明显小于对照组的小鼠体重，但其在第三周与对照小鼠体重无显著差异（p＞0.05）。对烟丝组来说，灌胃一周后其体重与对照组小鼠体重也是显著性降低（p＜0.05）。第四周仍然显著低于对照组小鼠体重。

2.2 对小鼠肝脏指数和脾脏指数的影响

3种不同食用方式对小鼠脏器指数的影响见表2。由表2可知，烟丝组和鲜槟榔组的肝脏脏器指数与蒌叶组的脏器指数有着明显的增高（p＜0.05）。然而对脾脏来说，只有鲜槟榔组与对照组相比显著增高（p＜0.05），其他各组间均无差异。

2.3 对小鼠血液指标的影响

3种不同食用方式对小鼠血液指标的影响见表3。

表2 3种不同食用方式对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of three different eating methods on organ index in mice

表3 3种不同食用方式对小鼠血液指标的影响Table 3 Effects of three different eating methods on blood parameters in mice

如表3所示，3种不同的食用方式对小鼠红细胞计数（red blood cell，RBC）并无明显的影响。对于白细胞计数（white blood cell，WBC）而言，其中烟丝组的白细胞计数（WBC）是要明显高于鲜槟榔组和对照组的（p＜0.05），相对上升了80.82%。蒌叶组的白细胞计数（WBC）也是明显高于这两组（p＜0.05），相对上升了32.05%。对鲜槟榔组来说，其白细胞计数（WBC）与对照组并无显著性差异。

2.4 对小鼠免疫球蛋白以及细胞因子的影响

3种不同食用方式对小鼠免疫球蛋白的影响见图1～图 3。

图1 3种不同食用方式的小鼠血清IgA的含量Fig.1 Serum IgA levels in mice with three different modes of consumption

如图1、2所示：鲜槟榔的3种不同食用方式对小鼠血清免疫球蛋白A（immune globulin A，IgA）和免疫球蛋白G（immune globulin G，IgG）的含量均呈显著性下降（p＜0.05）。由图3可知：烟丝组小鼠血清免疫球蛋白（immune globulin M，IgM）与对照组相比呈显著性升高（p＜0.05）。其余各组见均无明显差异。

图2 3种不同食用方式的小鼠血清IgG的含量Fig.2 Serum IgG levels in mice with three different modes of consumption

图3 3种不同食用方式的小鼠血清IgM的含量Fig.3 Serum IgM levels in mice with three different modes of consumption

3种不同食用方式对小鼠细胞因子的影响见表4。

表4 3种不同食用方式对小鼠细胞因子的影响Table 4 Effect of three different eating modes on cytokines in mice

从表4可知，对于小鼠血清肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）的含量来说，只有烟丝组与对照组相比呈显著性上升（p＜0.05），其他组分之间均无明显差异。对于小鼠血清白介素1（interleukin-1，IL-1）的含量来说，蒌叶组和烟丝组与对照组相比呈极显著差异（p＜0.01），鲜槟榔组与蒌叶组和烟丝组之间呈极显著下降（p＜0.01），同时鲜槟榔组与对照组相比则是呈极显著上升（p＜0.01）。

3 讨论

3.1 不同食用方式对小鼠体重的影响

本次试验结果表明：鲜槟榔的3种不同食用方式对小鼠体重均有着不同程度的影响，经过一周灌胃饲养后所有试验组分的小鼠体重与对照组小鼠体重相比均呈现显著性下降。在灌胃饲养的过程中，灌胃15 min至20 min后3个试验组的小鼠均有不同程度的腹泻现象，Chuan bao LI等[11]研究表明，槟榔中的槟榔碱对离体大鼠远端结肠平滑肌肌条具有收缩作用，并且其促收缩作用随着槟榔碱剂量的增加而增强，从而会造成不同程度的腹泻，因此所有实验组的小鼠在长期腹泻作用下，造成其体重与对照组相比较呈显著性下降。刘书伟等[12]指出鲜槟榔和蒌叶同时食用时可以抑制小鼠体重的增加，但其可以减弱对小鼠生理指标的毒性作用。故蒌叶组小鼠体重相对于鲜槟榔组来说，其对小鼠体重的抑制作用相对减弱。从本次试验结果来看烟丝组和蒌叶组对小鼠体重抑制作用大相径庭，然而烟丝对肠道的具体影响尚不明确，其对小鼠体重是否也存在抑制作用有待进一步的研究。

3.2 对小鼠脏器指数的影响

肝脏作为身体中最大的解毒器官，其在排毒代谢中有着重要的地位。本次试验中只有蒌叶组肝脏脏器指数与对照组之间存在显著性差异，其他各组均无明显差异。孙莹等[13]试验结果表明槟榔碱饮水法喂养小鼠会造成小鼠肝脏组织损伤，且在一定时间内，随时间变化损伤会加重，造成小鼠肝脏组织出血、细胞肿胀、肝细胞核分裂的现象逐渐加重。但其对肝脏脏器指数的影响并不明确，本次试验结果也仅仅表明蒌叶组小鼠肝脏脏器指数出现显著性下降，其他两组并无明显差异。

脾脏是重要的免疫器官，其脏器指数可以反映其免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况，本次试验中，鲜槟榔组对小鼠脾脏脏器指数显著升高，其他各组均无明显差异。但本次试验结果却与谭树华等[14]试验结果相反，其试验结果表明，槟榔水提物经过90 d自由食用后的小鼠脾脏脏器指数与对照组相比呈显著性下降。故槟榔对小鼠脾脏脏器指数的影响有待进一步的研究证实。

3.3 不同食用方式对小鼠红、白细胞计数的影响

红细胞和白细胞通常在骨髓中产生，最终由多能造血干细胞产生。白细胞包括粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）、单核细胞和淋巴细胞。红细胞在输送氧气方面起主要作用，在调节局部血流和二氧化碳输送方面起次要作用。中性粒细胞和单核细胞是吞噬细胞，是先天和适应性免疫反应的一部分[15]。本次试验结果表明，鲜槟榔3种不同食用方式对小鼠红细胞计数（RBC）并无明显影响。但是其对白细胞计数（WBC）却有着不同程度的影响，烟丝组和蒌叶组小鼠的白细胞计数（WBC）与对照组和鲜槟榔组小鼠的白细胞计数（WBC）呈显著性上升。白细胞计数的显著上升说明了，蒌叶组和烟丝组的混合提取液对小鼠体液免疫有不同程度的影响，白细胞计数的上升也说明了，这两组小鼠体内可能存在一定的炎症，具体是哪个部位的炎症目前尚不明确。

3.4 不同食用方式对小鼠细胞因子和免疫球蛋白的影响

3.4.1 对小鼠细胞因子的影响

肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，在人体免疫中有着无可厚非的作用。白介素1（IL-1）是一种细胞因子，属于白细胞介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，在传递信息，介导T、B细胞活化、增殖与分化以及在炎症反应中起重要作用。本次试验结果表明：烟丝组小鼠血清中癌症坏死因子（TNF-α）的含量与对照组相比较有显著性上升，其余各组之间均无差异。然而对于白介素1（IL-1）的含量而言，所有试验组分的白介素1（IL-1）的含量与对照组相比较均呈现显著性上升，与此同时烟丝组和蒌叶组的白介素1（IL-1）的含量与鲜槟榔组相比较也呈显著性升高。Sindy hu等[16]研究显示，在长期咀嚼槟榔的男性与健康男性在癌症坏死因子（TNF-α）和白介素1（IL-1）的含量之间存在着显著差异，健康男性这两个指标的含量均要显著低于长期咀嚼槟榔的男性。李霞等[17]试验结果指出：槟榔提取物干预角朊细胞12 h后，TNF-α的量开始增加，并以剂量依赖关系增加角朊细胞产生TNF-α的量，从而诱发口腔黏膜下纤维性变。这也很好的说明了槟榔确实对小鼠这两种细胞因子的含量存在明显的影响。然而胡怡秀等[18]的试验结果却指出槟榔对细胞免疫无明显影响，其结果与本次试验结果截然相反，造成其结果截然不同的原因可能是因为其当初设计的剂量并未能使槟榔对细胞免疫产生显著影响。

3.4.2 对小鼠免疫球蛋白 A（IgA）、G（IgG）、M（IgM）的影响

IgG和IgA参与多种免疫功能和过程，包括对微生物感染的保护、体液免疫、免疫稳态和癌症监测[19-20]。本次试验结果表明：鲜槟榔的3种不同食用方式对小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量均呈显著性下降。高华北等[21]报道指出槟榔加工者在槟榔加工过程中由于接触槟榔其免疫功能受到一定程度的损害，槟榔工作者组与正常人组免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量呈显著性下降，并且槟榔加工者免疫功能随环境变差而降低，同时也随着工龄增长而减低。张志军等[22]研究表明，小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量与茯苓多糖剂量呈正相关，其研究指出小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量增高具有一定的免疫增强的效果。熊政委等[23]的研究结果表明，菊糖能够刺激酸奶中乳酸菌的增加。与普通酸奶相比，菊糖酸奶能够更好地提高小鼠免疫功能，经相关性分析发现IgG、IgA与酸奶中乳酸菌的含量显著相关。这也进一步印证了小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量增高与小鼠免疫功能增强存在着必然联系。本次试验中小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量与对照组相比均呈显著性下降，这3种不同食用方式均对小鼠免疫功能呈负面影响。

免疫球蛋白M（IgM）是所有脊椎动物物种中唯一存在的一类抗体，占血清免疫球蛋白总量的5%～10%[24]。王素英[25]、郑敏华等[26]试验结果表明，免疫球蛋白A（I-gA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量显著性降低，然而免疫球蛋白M（IgM）的含量显著性上升，均出现在免疫功能低下与功能紊乱的情况中，故此说明了可以用免疫球蛋白含量变化为标准来评价其对小鼠免疫功能的影响。本次试验结果显示，烟丝组小鼠血清免疫球蛋白M（IgM）与对照组相比呈显著性升高（p＜0.05）。烟丝组小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量均呈显著性下降。

4 结论

鲜槟榔的3种不同食用方式对小鼠体重增长均有一定的抑制性，其中鲜槟榔单独食用对其抑制作用明显。对于白细胞计数（WBC）而言，烟丝组和蒌叶组这两种食用方式可以明显的增加小鼠血清白细胞计数（WBC），而鲜槟榔单独食用则不会增加小鼠血清白细胞计数（WBC）。对于细胞因子和免疫球蛋白而言，3种不同食用方式对其存在着不同程度的影响，其中烟丝组的食用方式会明显增加小鼠血清癌症坏死因子（TNF-α）、白介素 1（IL-1）以及免疫球蛋白 M（IgM）的含量，然而蒌叶组的食用方式则只会增加小鼠血清白介素1（IL-1）的含量，与此同时鲜槟榔单独食用也会增加小鼠血清白介素1（IL-1）的含量，但是鲜槟榔组的白介素1（IL-1）的含量还是要显著低于烟丝组和蒌叶组。综合以上各种结果而言，烟丝组的食用方式对降低小鼠免疫功能最为明显，其次就是蒌叶组的食用方式，相对影响较小就是鲜槟榔组的食用方式。为此本次试验只能为这3种不同食用方式对小鼠免疫功能损害程度提供最基础的建议，如需更详细的结果论证，还有待进一步的研究.