不同类型子痫前期孕妇血清及胎盘组织中GRP78、P53蛋白表达意义

方 芳 朱锦明

1.徐州医科大学研究生学院 (221004)；2.徐州医科大学附属徐州妇幼保健院

子痫前期常伴随水肿、头痛、恶心、胃痛及呕吐等症状，分娩结束后通常会消失[1]。子痫前期会对妊娠女性肝、肾等脏器功能及大脑功能造成损伤，同时可导致胎儿供血量和供氧量不足，严重威胁胎儿和母亲生命健康[2]。目前，学术界普遍认为子痫前期可能是由胎盘血液循环出现紊乱引起，但其确切发病机制尚未研究清楚。有研究报道，内质网应激反应影响胎盘功能、胎盘滋养细胞分化及凋亡，而子痫前期发病期间胎盘血氧量不足等有害因素会启动内质网应激反应，因此，内质网应激相关调节功能异常是引发子痫前期的发病机制之一[3]。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)与蛋白质折叠及组装，P53蛋白主要与细胞凋亡有关，以上两种蛋白分子被认为与胎盘滋养细胞内质网应激反应及相关凋亡途径紧密关联[4-5]。本研究通过测定GRP78、P53蛋白在不同类型子痫前期孕妇血清及胎盘组织中的表达，探讨其生物学作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经本院医学伦理委员会审批，且患者及家属知情同意后，选取60例2018年1月—2018年12月本院妇产科接受治疗的子痫前期妊娠女性为研究对象。纳入标准：①诊断标准《妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)》[6]；②年龄23～45岁；③单胎妊娠；④均剖宫产分娩。排除标准：①合并糖尿病、慢性高血压、心血管疾病及自身免疫疾病；②合并心肝肾功能障碍；③合并其他妊娠并发症。60例均为重度子痫前期患者，其中早发子痫前期30例(早发组)，年龄(29.3±5.8)岁，分娩孕周(33.2±6.2)周；晚发子痫前期30例(晚发组)，年龄(28.6±5.3)岁，分娩孕周(36.7±7.2)周。另外选取同期本院健康妊娠女性30例为对照组，年龄(29.53±6.28)岁，分娩孕周(39.5±7.8)周。3组年龄比较无差异(P>0.05)，分娩孕周比较有差异(P<0.05)。

1.2 蛋白检测

1.2.1血清GRP78、P53蛋白采集3组外周静脉血清，采用酶联免疫吸附法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及P53蛋白水平，试剂盒由cloud-clone corp公司生产，仪器采用瑞士Tecan公司的Freedom Evolyzer-2200型全自动酶免疫分析仪。

1.2.2胎盘组织GRP78、P53蛋白中央带母体面至胎儿面1.0cm×1.0cm×1.0cm，避开梗死及钙化区，去除母体面约4mm脱膜组织，用无菌生理盐水清洗处理后分装2管，各0.1g。取其中1份10%福尔马林固定，24h后常规石蜡包埋切片，依次脱蜡、水化、过氧化物酶阻断、抗原修复、PBS漂洗，免疫组织化学染色(SP)检测GRP78、P53蛋白水平。GRP78一抗为兔抗人单克隆抗体，按1:100稀释；P53蛋白一抗为鼠抗人单克隆抗体，按1:50稀释，二抗为山羊免抗IgG，用二氨基联苯胺呈色，光学显微镜下观察。另一份胎盘组织迅速用液氮冷冻， -80℃保存，用半定量逆转录多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测GRP78及P53mRNA表达。PCR循环参数分别为预变性5min(94℃)、变性0.5min(94℃)、退火0.5min(60℃)、延伸0.5min(72℃)，共进行35个循环。GRP78上游引物5'-ATCAGGGCAACCGCATCACACC-3'，下游引物5'-ACGCCTCGGCAGTTTCCTTCATTT-3'，内部参照上游引物5'-CAGGCGTAGGAATATGGAC-3'，下游引物5'-CGTGGCTTTACTTGGAGAA-3'；P53上游引物5'-GACCTGGTCCTCTGACTGCT-3'，下游引物5'-GATACGGCCAGGCATTGAAG-3'，内部参照上游引物5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3'，下游引物5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

1.3 统计学方法

采用spss23.0软件统计分析。计数资料采用F检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中GRP78、P53蛋白水平

血清GRP78、P53蛋白水平对照组低于早发组和晚发组(P<0.05)，早发组与晚发组无差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组血清中GRP78、

2.2 胎盘组织中GRP78 mRNA、P53 mRNA表达

胎盘组织中GRP78 mRNA、P53 mRNA表达水平早发组和晚发组均高于对照组(P<0.05)，早发组和晚发组比较无差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组胎盘组织中GRP78 mRNA、P53 mRNA表达水平

2.3 胎盘组织中GRP78、P53蛋白表达组化分析

3组胎盘组织中均有GRP78、P53蛋白表达。GRP78 蛋白主要表达于细胞质，呈棕黄色染色，对照组表达在黄色和浅棕色，早发组和晚发组表达在深棕色和浅棕色区域，早发组和晚发组比对照组棕色颗粒表达增高。P53蛋白主要表达于细胞滋养层细胞、绒毛间质滋养层细胞及合体滋养层细胞。早发组和晚发组胎盘组织中GRP78、P53蛋白阳性表达高于对照组(P<0.05)，早发组和晚发组比较无差异(P>0.05)，见表3。

表3 胎盘组织中GRP78、P53蛋白表达[例(%)]

3 讨论

子痫前期属妊娠期特发并发症，轻度无明显症状，但会导致患者体重快速增加，且手部和面部出现不同程度突发性肿胀；重度子痫前期可以导致严重头痛、呼吸障碍、视力障碍、排尿减少及腹痛等症状[7]。近年研究报道，质网应激相关分子肌醇依赖酶1α(IRE1α)、GRP78 及内皮素 -1(ET-1)等在子痫前期表达异常，并参与子宫螺旋动脉重建及滋养细胞的增殖与分化，导致子痫前期发生[8-9]。本研究通过对子痫前期孕妇血清及胎盘组织中GRP78、P53蛋白水平变化，探讨其临床意义。

GRP78是位于内质网上的一种应激蛋白，当内质网发生应激反应时，GRP78可通过提升自身表达量控制蛋白质折叠与转运来阻止细胞凋亡，从而维持机体内环境稳定[10]。本研究发现，GRP78蛋白、GRP78mRNA在子痫前期妊娠患者血清及胎盘组织中表达量均高于健康孕妇，但在早发与晚发组未见差异，提示GRP78参与了子痫前期发病机制。分析认为：是由于在子痫前期患者机体内存在氧化应激反应，使组织处于缺氧、低糖环境，诱导GRP78大量生成，造成GRP78升高[11]。王耸等[12]研究了GRP78蛋白在子痫前期胎盘滋养细胞中的表达，发现子痫前期、早发型及晚发型子痫前期胎盘组织中GRP78蛋白均呈现高表达，且子痫前期程度组间未见差异，与本研究结果相符。

P53蛋白是控制细胞周期及凋亡的抑癌基因P53的表达产物，具有调节细胞凋亡、DNA修复及抑制血管生成等作用。有研究证实，P53蛋白在胎盘滋养细胞中表达水平存在变化，可能与胎盘形成与浸润有关[13]。王喜慧等对子痫前期发病及严重程度与 VEGF和P53表达相关性研究发现，患者血清及胎盘组织中VEGF与P53呈高度负相关，证实了P53通过调节VEGF水平引发血管内皮功能紊乱，进一步导致子痫前期发生[14]。本研究检测结果显示，子痫前期患者中P53表达高于对照组，但早发型与晚发型无明显差异，提示P53参与了子痫前期的发生。分析认为：通过促进滋养细胞凋亡而影响胎盘形成所致P53表达升高。此外，有研究指出，在长时间缺氧状态下，P53可通过p21途径在转录因子E2F上发挥直接作用，抑制血管内皮生长因子表达，加重血管内皮损伤，继而加重子痫前期病情[15]。

本研究分析显示，血清中GRP78、P53表达有明显相关性，是由于P53表达可导致血管内皮功能紊乱，促使大量缩血管物质在血液中释放，造成血管痉挛收缩，滋养细胞缺氧缺血，产生大量应激刺激，诱导GRP78大量表达，而GRP78的大量生产又加重机体氧化应激反应，造成血管损伤，两者互相联系进一步加重病情。

综上所述，子痫前期孕妇血清及胎盘组织中GRP78、P53蛋白及GRP78mRNA、P53mRNA均呈高表达，但表达量与病情无明显相关性，预示GRP78、P53蛋白水平变化及其基因表达异常可能与子痫前期发病机制有关，可作为子痫前期早期预测指标，为临床治疗提供有效参考。但本研究由于时间限制，仅观察了重度子痫前期患者，未分析血清GRP78、P53与患者临床指标和妊娠结局关系，且样本量过少，对上述不足需有待进一步研究。