急性肝衰竭小鼠necroptosis的发生及Nec-1的干预作用研究

赵攀，杨昊臻，高雪，段锋，陈婧，刘歆颖，徐军

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)主要以凝血异常和肝性脑病为临床特征[1]，发病快、进展迅速、预后差、病死率极高[2]。肝移植是目前内科保守治疗失败时惟一有效的救治方式，但ALF的发病急骤、肝源短缺导致我国ALF的肝移植率极低。故此，研究ALF的发病机制就显得相当重要，旨在促进全新且有效的内科治疗方法的产生[3]，从而改善ALF的预后并降低ALF相关的肝移植率和病死率。

ALF的发病机制复杂，最明显的病理学特征是大量肝细胞的死亡[4-5]。程序性坏死(necroptosis)是近几年被发现和描述的一种不依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)激活的细胞程序性死亡方式，由受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein, RIP)介导且可被程序性坏死特异性抑制剂-1(necrostatin-1, Nec-1)所抑制。虽然程序性坏死与凋亡有共同的上游分子机制，但是两者结果不同。程序性坏死的最终结果是线粒体功能障碍，细胞器及细胞肿胀破裂，质膜透化，细胞内含物漏出，周围组织产生炎性反应[6-7]。与凋亡相区别的是，程序性坏死不影响核固缩，不产生核小体DNA片段。 现探讨程序性坏死在ALF发病中的作用机制并观察Nec-1对ALF预后的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物来源：SPF级雄性C57/BL6小鼠60只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，6～7周龄，体质量20～25 g，室温饲养，饲料为普通动物饲料。(2)试剂试药：受体相互作用蛋白-1(RIPl)、受体相互作用蛋白-3(RIP3)、β-actin购自Santa公司，均为兔抗来源，稀释比例分别为1∶400、1∶500、1∶1 000；Nec-1、甘氨酸、过硫酸胺(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰、Tween-20、丽春红染色液、二甲基亚砜(DMSO)、D-半乳糖胺(D-GalN)、脂多糖(LPS)均购自Sigma公司，D-半乳糖胺(D-GalN)和脂多糖(LPS)均使用无菌等渗盐水溶解，分别配置成D-GaIN 100 mg/ml，LPS 1 mg/ml原液并分装保存。(3)仪器设备：PCR仪(Thermo Electron Corporation生产)、离心机(Thermo Electron Corporation生产)、旋涡混合器(海门市麒麟医用仪器厂生产)、生化分析检测仪(美国Beckman Coulter公司生产)、电泳仪(Major Science生产)等。

1.2 实验方法 2017年6月—2018年3月在解放军总医院第五医学中心进行动物实验。小鼠以随机数字表法分为3组，每组20只：模型组，D-GalN 350 mg/kg和LPS 30 μg/kg腹腔注射造模；对照组，腹腔注射与模型组等体积无菌生理盐水；干预组，造模方法同模型组，造模前10 min给予Necrostatin-1 20 mg/kg溶于二甲基亚砜(DMSO)；各组分别于注射后(干预组于造模后)1 h、2h、3h断颈处死小鼠，每个时间点5只，留血并取小鼠肝左叶浸入4%多聚甲醛，常规石蜡包埋，切片厚度5 μm，苏木素—伊红(HE)染色，由一位有经验的病理科医师对肝组织病理学变化进行评估。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 血清ALT及炎性因子检测：小鼠血清ALT采用Beckman全自动生物化学分析仪进行测定，血清TNF-α、IL-6、IL-10采用ELISA试剂盒进行检测。

1.3.2 RIP检测：(1)取小鼠肝组织20 mg，每10 mg组织加入组织蛋白裂解液100 μl,用玻璃研磨器于冰上匀浆。将匀浆液转移到预冷的1.5 ml EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解。4℃，12 000 r/min离心10 min。将离心后的上清分装转移到0.5 ml的离心管中，-20℃冻存。(2)将BCA试剂A和BCA试剂B以50∶1配制适量BCA工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，取10 μl稀释至100 μl，终浓度为0.5 mg/ml。将标准品按0、1、 2、 4、 8、 12、 16、 20 μl加到96孔板的标准品孔中，加入用于稀释标准品的溶液并补足到20 μl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加入用于稀释标准品的溶液并补足到20 μl。各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min。根据标准曲线计算出蛋白浓度。(3)配胶电泳，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。(4)PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透，转膜60 min。转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T中清洗5 min。用TBST配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1 h。(5)用封闭液将一抗按照一定比例稀释，RIP1(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶400；RIP3(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶500；β-actin(Cell Signaling Technology提供)按1∶1 000，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜。孵育结束，TBS-T清洗3次，每次5 min。(6)用封闭液稀释HRP标记的二抗(羊抗兔IgG，Santa Cruz Biotechnology提供)，稀释比例1∶10 000，将稀释后的二抗与膜共同孵育1 h。孵育结束，TBS-T洗3次，每次5 min。(7)ECL曝光，将显色后的膜扫描，用IPP6软件对图像进行灰度分析。

2 结 果

2.1 血清ALT及炎性因子比较 与对照组比较，造模后1 h模型组小鼠ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。干预组ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 肝组织RIP1和RIP3表达比较 与对照组比较，造模后1 h模型组小鼠肝组织RIP1和RIP3的表达明显升高(t=5.867，P<0.001；t=4.388，P=0.002)；与模型组比较，干预组RIP3的1 h、2 h、3 h表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，RIP1在1 h和2 h水平差异无统计学意义(P>0.05)，但其3 h的水平低于模型组且差异有统计学意义(t=2.416,P=0.041)。见图1、2。

表1 不同组别小鼠血清ALT及炎性因子比较

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

图1 各组小鼠肝组织RIP1表达情况(标示值为均值)

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

图2 各组小鼠肝组织RIP3表达情况(标示值为均值)

2.3 小鼠肝组织病理变化 造模后1 h、2 h、3 h，模型组小鼠的病理变化随时间递进而加重，3 h肝细胞肿胀明显伴有大量炎细胞浸润，而干预组3 h的病变程度明显好于模型组。图3见封3。

3 讨 论

课题组成员前期进行了D-GalN和LPS造模的动物实验研究，在模型的优化方面积累了较好的经验[8]。D-GalN是一种肝毒性药物，通过半乳糖途径代谢并消耗该途径的中间代谢产物尿苷二磷酸，进而抑制尿嘧啶核苷的代谢，导致核蛋白质合成受阻，引起肝细胞损伤。LPS是革兰阴性菌胞壁成分，可引起细胞吞噬功能障碍，导致血浆内毒素水平升高，进一步诱发肝衰竭[9]。

ALF的病死率极高，除外其发病急骤的特征外，缺乏有效的内科治疗是造成ALF病死率居高不下的最主要原因[10-12]。随着necroptosis被新近发现并在多种器官疾病的发病机制中得到深入研究，necroptosis与肝脏疾病的联系开始受到关注[13]。Gautheron等[14]的报道显示，RIP3依赖的necroptosis调控非酒精性脂肪性肝炎诱导的肝纤维化，并预测这一通路很可能启示新的和特定的非酒精性脂肪性肝炎药物治疗策略的产生。Roychowdhury等[15]的研究表明，小鼠RIP3的缺失可防止乙醇诱导的肝损伤。Li等[16]的研究显示，选择性抑制RIP3可缓解对乙酰氨基酚引起的肝损伤。

虽然necroptosis与上述肝脏疾病的关系已有所阐述，但其在ALF中的机制探讨非常少见。Takemoto等[17]的实验结果显示，Nec-1可以拮抗necroptosis过程中ROS诱导的肝脏毒性，对乙酰氨基酚引起的ALF有防护作用。本结果显示，RIP1和RIP3蛋白在急性肝衰竭小鼠的肝脏中表达显著升高，表明急性肝损伤时necroptosis明显发生，但具体机制需要进一步研究[18-19]。此外，作为necroptosis的特异性抑制因子，Dec-1对降低肝损伤时的ALT和相关炎性因子水平具有较好效果，值得进行深入研究。

本实验在造模后1 h，模型组ALT、TNF-α、IL-6、IL-10、RIP1、RIP3较对照组显著升高，标志造模成功，necroptosis发生；干预组与模型组比较，相关指标降低明显，表明Nec-1对ALF时发生的necroptosis有显著改善作用，而且肝脏病理组织评估结果亦有改善。该研究发现与Takemoto等[17]的实验结论一致，表明急性肝损伤时有necroptosis的发生，特异性抑制剂Nec-1可以改善ALF的病变进展。

本研究未对动物的生存率进行观察，是本研究的局限性所在。但是，本研究论证了程序性坏死在急性肝衰竭中的发生情况并观察了程序性坏死特异性抑制剂-1对肝细胞程序性坏死的抑制作用，达到了先期的既定目标，为进一步明确急性肝衰竭的发病机制及开发新的治疗策略提供了数据支持和参考。

利益冲突：无

作者贡献声明

赵攀：研究设计，数据分析，文献调研，论文撰写，论文终审；杨昊臻：研究设计，实验实施，论文修改；高雪：数据分析，论文修改；段锋：实验实施，论文终审；陈婧：数据分析，论文终审；刘歆颖：实验实施，论文修改；徐军：实验实施，论文修改