鸡新城疫病毒分离鉴定及鸡胚免疫的方法研究

刘华栋，李婷婷，唐 娟，陆冰洋，丁树荣，王彩先*

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原 030032）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种烈性传染病，该病具有发病急、死亡快、死亡率高等特征[1]。本病是危害我国养禽业生产的最严重疾病之一[2]。而且不同NDV 毒株的毒力差别很大[3]。新城疫防控使用的疫苗和免疫程序都已经成熟，但在临床上仍然发病，而且流行很严重，成为最难以防治的疾病之一[4]。新城疫发病越来越早，甚至在胚胎中可以检测出不同毒力的病毒[5、6]，初生的雏鸡就会发病，表现出ND 的症状和病变。本研究采取鸡胚接种的方式进行免疫，孵出后的雏鸡能检测到抗体，且不会造成鸡胚的死亡，可以为养殖场防控本病提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料

病料采自山西地区某养鸡场。发病鸡使用咽肛拭子采集病料，将棉签用灭菌生理盐水浸湿后分别在鸡的喉头、气管和泄殖腔内轻触后将其置于1.5 mL 的离心管中，加入灭菌的50%的甘油生理盐水，做好标记。剖检病鸡后，无菌取其肝脏、脾脏、肺脏等器官置于无菌的一次性封口袋中，做好标记。采集的样本在放置冰袋的保温盒中保存，带回实验室后置于-20℃的冰箱保存。

1.2 试验动物

1 日龄、6 周龄龄的雏鸡，均由SPF 蛋孵化，在山西省农业科学院畜牧兽医研究所试验动物房饲养。

1.3 试剂

新城疫病毒通用型RT-PCR 检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司），RNA 提取试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）；M-MuLV 第一链cDNA 合成试剂盒（BS249），Dream-Taq DNA 聚合酶、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；PCR 产物纯化回收试剂盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司SK1131）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa）；蔗糖、琼脂糖、琼脂粉、营养琼脂、阿氏液（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；SPF 蛋（北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司）。引物序列合成和基因测序（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）。鲜血琼脂培养基，购自青岛日水科技有限公司。

1.4 PCR 鉴定

取病死鸡的肺脏、肝脏、脾脏等器官混合后称取1 g，用手术剪剪碎混匀后取0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，8,000 rpm 离心2 min，取上清液100 μL 于1.5 mL 灭菌离心管中。病毒RNA 提取、扩增参照新城疫病毒通用型RT-PCR 检测试剂盒说明书，按照步骤操作进行。

1.5 病毒的分离培养

将病死鸡脑组织通过反复冻融3 次，研磨，按1：5 加入灭菌生理盐水，加入双抗（5,000 U（μg）/mL）37 ℃感作1 h，3,000 rpm 离心30 min，取上清液。使用一次性无菌注射器抽取上清液，去掉针头，与滤膜过滤器连接，通过使用0.22 μm 的滤膜过滤后，将滤液于-20 ℃保存备用。

取100 μL 滤液分别接种于马丁肉汤、血液琼脂平板、厌氧肉肝汤和沙氏斜面，37 ℃培养96 h，观察结果。

取无菌上清液，尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚10 枚，接种灭菌生理盐水2 枚作为阴性对照，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，弃去24 h 内死亡的鸡胚，每日照蛋两次，收集死亡胚中尿囊液，至96 h 收冻未死鸡胚，无菌收集鸡胚尿囊液，-20 ℃保存备用，并观察鸡胚病变。

1.6 基因毒力测定

1.6.1 引物设计 根据国内外已发表的F 基因序列，使用软件Primer Premier 设计一对引物，用于扩增F 基因94～457 区段363 bp。F-F：5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'；F-R：5'-GGAGGATGT T GGCAGCAT-3'。

1.6.2 反转录 反转录按照试剂盒说明书操作。

1.6.3 PCR 反应PCR 加样方式为：10×DreamTaq Buffer 10 μL，dNTP（10 mM）6 μL，Template 20 μL，Taq 酶（5U/μl）0.5 μL，MgCl26 μL，上下游引物各2 μL（25 pmol/μL），超纯水加至100 μL，进行RCR 扩增。

PCR 反应条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行35 个循环；72 ℃延伸10 min，结束反应。取PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取阳性目的片段用胶回收试剂盒进行回收。

1.7 序列分析

序列比对、同源性分析、亲缘树构建使用软件为DNAStar，DNAMAN。

1.8 生物学毒力测定

对所分离到的病毒的毒力测定，主要测定其MDT、IVPI、ICPI三个指数。测定方法用OIE 标准[7]操作。

1.9 动物回归试验

取2 周龄非免疫雏鸡10 只，接种前采血进行HI 试验，结果为阴性，通过滴鼻点眼的方式接种病毒，滴入第三代鸡胚尿囊液，对照组滴入生理盐水，滴入量为0.1 mL/只。分离病毒株攻毒5 只鸡，对照组5 只鸡。隔离饲养，观察两周，记录发病情况，从发病鸡中分离病毒进行PCR 鉴定。

1.10 病毒效价检测

应用血凝试验检测培养病毒的效价。血凝试验参照国标GB/T 14926.53—2001 操作。

1.11 鸡胚免疫

取40 枚18 日龄的SPF 蛋，在气室中接种病毒，接种方法为：将收集的鸡胚尿囊液用0.9%生理盐水进行稀释，选用稀释后抗体效价为21、22、23、24的稀释液备用。将SPF 鸡胚消毒后，在其气室部位的中央的蛋壳上打孔，而后将注射器针头经孔向卵中心方向刺进，大约10 mm 深时将稀释液注入，每枚蛋注入0.2 mL，用石蜡封孔后置于孵化箱内继续孵化，前72 h 不翻蛋。另取10 枚SPF 蛋作为对照，待雏鸡出壳后24 h，通过心脏采血，应用血凝抑制试验检测其血清中的抗体效价。

2 结果

2.1 PCR 鉴定结果

由图1 可见，病料扩增出362 bp 的特异性条带，与阳性对照条带一致。

2.2 分离鉴定结果

病毒接种鸡胚后，死亡的鸡胚在头颈部甚至周身都有出血情况。尿囊液浑浊。

2.3 基因毒力测定结果

由图2 可见，扩增出大小为363 bp 的特异性条带。

2.4 序列分析结果

从测序结果已知，分离株的112～117 位的氨基酸顺序为GRQGRL，与标准的弱毒株的顺序相同。101 位氨基酸为R，121 位氨基酸为I，与弱毒株相同。表明分离株为弱毒株。同源性比较和亲缘关系比较见表1 和图3。

由表1 可知NDV 山西分离株SX-2 与Clone30、La Sota 和VG/GA 株的同源性最高，均达到96%以上，与Clone30 和La Sota 株的同源性相同，同为最高，达到97.8%。

由图3可见，NDV分离株SX-2 与Clone30、La Sota 和VG/GA 株同处于同一个大的分枝，亲缘关系最近。

2.5 生物学毒力测定结果

表1 NDV 分离株和国内外毒株同源性比较

通过对分离病毒的MDT、IVPI、ICPI 等三个指数的测定，结果MDT 为92.5，IVPI 为0.2，ICPI 为0。

2.6 动物回归试验结果

鸡在攻毒后第4 天表现为精神萎靡，食欲不振，有的鸡拉黄绿色稀便，无死亡。剖检病鸡，可见腺胃乳头有少量点状出血，腺胃和肌胃交界处也见有少量出血点。十二指肠有散在的出血点，双侧盲肠扁桃体均出血。采集内脏组织进行PCR 鉴定，均能够出现特异性条带。

2.6 病毒效价检测结果

通过对病毒采用血凝试验检测，其病毒效价为25。

2.7 鸡胚免疫结果

由表2 可知，孵出后1 日龄的雏鸡血液中可以检测到ND 抗体，而对照组均无抗体。表明这种方法可行。当病毒效价高于22时，鸡胚就会出现死亡情况。所以选用病毒效价为22作为免疫效价。

表2 NDV鸡胚免疫后雏鸡效价表

3 讨论

本次从山西省鸡场采集病料，通过对其进行PCR 鉴定，扩增出262 bp 的条带。对病原通过鸡胚尿囊腔内的培养和扩增病毒，扩增其毒力相关的F 基因，扩增出263 bp 的条带。测序后将序列同国内外已知序列进行比对，可见分离病毒从基因上显示为弱毒株，为基因Ⅱ型。对其进行生物学毒力测定，结果见MDT 为92.5，IVPI 为0.2，ICPI 为0 也证明了分离株为弱毒株。通过回归试验表明分离病毒具有明显的致病性，确定其为野毒株，并非疫苗株。说明本地区存在新城疫弱毒株的感染，只是不易被发现。

国内对鸡胚进行免疫的研究早在1984 年[8]，最初是用来接种马立克氏病毒疫苗，并获得成功。国外已经应用本方法来免疫马立克氏病[9]。王振国[10]等在1986 年开始研究用此方法预防新城疫，通过在蛋内接种NDV 疫苗，研究不同日龄的鸡胚和不同稀释度的疫苗在不同部位接种后的对孵化率和免疫效果的影响。结果表明在18-19 日龄接种最好，接种部位是以气室和卵黄囊部位最好，并指出接种部位与接种病毒浓度具有相关性。朱尧生[11]表明鸡胚发育到第18 天，其免疫系统已基本建立，能够对某些抗原产生较好的免疫应答，而且可以避开母源抗体的干扰[9]。后来彭远义[12]、艾国良[13]等人分别进行了鸡胚接种的研究，表明在18 日龄接种为最佳，接种部位为气室。本研究也是针对18 日龄的鸡胚进行免疫接种，选择气室作为接种部位，通过试验筛选出合理的接种病毒效价。雏鸡具有较高的抗体效价水平，而且生长发育良好。

目前国内的研究所使用的鸡胚均为普通鸡胚，本身就带有母源抗体，虽然抗体的干扰较小，但并不能排除干扰，而本研究使用的是SPF 鸡胚，不含有ND 母源抗体，能更好的说明初生雏鸡的抗体是由免疫产生的。

之前的研究均使用NDV 疫苗进行鸡胚的免疫，而本研究首次使用本地分离株进行试验，取得了良好的免疫效果。说明养鸡场可以使用本场的分离株进行鸡胚免疫，更有针对性的防控ND。