百色市RABV 野毒株与疫苗株N 基因同源性比对分析

潘懿，霍秀龙，韦显凯

（1.百色市农业农村局广西百色 533300；2.平果县动物疫病预防控制中心广西百色 531400；3.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心南宁 530001）

RABV（狂犬病毒）蛋白质占74%，其中N 蛋白占36%[1]，N 蛋白具有五个方面特性：①变异几率较底，稳定性高；②与病毒免疫直接相关，能刺激机体产生CELL 免疫和体液免疫反应；③保护RABV 在复制过程中免遭破坏；④病毒RNA 从转录向复制切换起到重要作用；⑤调节病毒的转录与复制的过程。因此，开展N 基因序列检测对筛选RABV 疫苗毒株具有重大意义。近年来狂犬病病例虽然在全国有所下降，但仍然是传染病重点防控对象，广西属狂犬病主要疫区，百色市是重灾区。RABV 主要侵害动物和人的神经系统，95%的病例是被带毒动物咬伤感染的[2]，因此，对动物狂犬病开展高密度免疫是防控狂犬病主要手段，选择动物狂犬病疫苗毒株显得尤为重要。为做好疫苗毒株选择，本试验通过分析百色市RABV 流行野毒株与疫苗株N 基因间的差异，最终选定疫苗毒株，为百色市狂犬病防控打基础。

1 检测样品来源

2009-2012 年从百色市12 个县（市、区）临床健康犬脑组织标本470 份，宠物门诊和农户散养犬唾液178 份，-20℃冻存送检。

2 RABV 分离、鉴定和基因序列测定

1）分离、鉴定及PCR 产物回收鉴定等由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心兽医实验室操作完成。

2）RABV N 基因序列分析提取PCR 产物送上海生物公司进行序列测定。

3 RABV N 基因序列、功能区氨基酸序列比对

本次测序共获得RABV4 株野毒N 基因序列，分别编号为：1号、2 号、3 号、4 号，病毒N 基因核苷酸全长1425bp，测出开放阅读框为1353bp，推导氨基酸编码450 个。

3.1 RABV 野毒株与疫苗株N 基因核苷酸、氨基酸同源性比对

Kissi 等[3]提出RABV 分型标准，野毒株N 基因核苷酸和氨基酸序列同源性为88.9%～99.3%和98.4%～99.1%，为基因I 型；1 号与2 号、3 号、4 号菌株核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和99.3%、88.9%和89.2%、88.9%和89.2%。按照核苷酸和氨基酸同源性分析可分成两个亚群，1 号、2 号菌株为一个亚群，3 号、4 号菌株为另一个亚群。N 基因野毒株与CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11株和ERA 株核苷酸同源性比对验证结果分别为：89.7%～95.5%、87.4%～88.3%、87.4%～87.9%和87.6%～88.5%；氨基酸同源性比对验证结果分别为：98.4%～99.1%、98.2%～98.6%、97.3%～98.9%和97.1%～97.3%。野毒株与CTN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，见表1。

3.2 磷酸化位点389、375 位点比对

表1 RABV野毒株与疫苗株N基因核苷酸、氨基酸同源性比较

磷酸化位点389、375 位与疫苗株保持高度一致。1～4 号野毒株S389 高度保持稳定，T375 与疫苗株保持高度一致[4]。

3.3 N 基因的各个功能区氨基酸序列比对

将已知N 基因5 个功能区182 个氨基酸序列野毒株与疫苗株差异比对。野毒株与CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差异百分比分别为：0.67%～1.11%、0.89%～1.11%、1.11%～2.44%、1.56%～2.22%，野毒株与CTN-1 差异最小，Flur-HEP 株次之，ERA 株差异最大，见表2。

1）维持N 蛋白构型有关的功能区氨基酸序列抗原位点进行比对。疫苗株与野毒株功能区35 个氨基酸序列进行比对，野毒株与CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA株差异百分比分别为：17.1%、17.1%、22.9%、25.7%，野毒株与CTN-1 株、Flur-HEP 株差异最小，ERA 株差异最大[5]。

表2 野毒株与疫苗株功能区氨基酸序列差异百分比（%）

2）诱导机体产生细胞免疫反应的功能区氨基酸序列抗原位点进行比对。将功能区58 个氨基酸序列疫苗株与野毒比对，野毒株与CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差异百分比分别为：12.1%、12.1%、15.5%、24.1%，野毒株与CTN-1 差异最小，ERA 株差异最大[6,7]。

3）激活体内外Th 细胞的功能区氨基酸序列抗原位点进行比对。激活Th 细胞产生免疫因子相关功能区41 个氨基酸序列比对，野毒株与CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差异百分比分别为：5%、5%、5%、15%，野毒株与CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11 株差异最小，ERA 株差异最大[8,9]。

4）促进机体的体液免疫功能区氨基酸序列抗原位点，共30 个氨基酸序列进行比对，野毒株与CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差异百分比分别为：0.0%、13.3%、26.6%、13.3%，野毒株与CTN-1株无差异，CVS-11 株差异最大[10]。

4 结论

综合上述结果，表明百色市目前流行RABV 为基因I 型，可分成2 个亚型毒株，经核苷酸、氨基酸、功能区氨基酸序列和免疫机能有关的功能区氨基酸序列比对，野毒株与CIN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，亲缘性最近，N 基因功能区及免疫机能有关功能区氨基酸序列差异最小，Flury-HEP 株次之，CIN-1 株应是百色地区防控狂犬病首选疫苗毒株。