野菊水提物和醇提物抗氧化及保肝活性研究

梁 诗，李 煊,,，陈良华，黄 雯，许传俊，童庆宣,，林 毅，明艳林,,

(1.厦门华侨亚热带植物引种园/厦门市植物引种检疫与植物源产物重点实验室，福建 厦门 361002；2.华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；3.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门361006)

野菊Chrysanthemum indicum属菊科多年生草本植物，广泛分布于我国大部分地区，生于山坡草地、田边、路旁等地带[1]。野菊在我国已有两千多年的药用食用历史，入药最早见于《神农本草经》[2]，现收录于《中华人民共和国药典》(2015版)。其气芳香，味苦、辛，性微寒，具清热解毒、泻火平肝的功效，用于治疗疔疮痈肿、目赤肿痛、头痛眩晕等[3]。现代药理研究发现，野菊提取物具有抗炎[4]、抗氧化[5—6]、抗肿瘤[7—8]、抗菌[9—10]、抗病毒[11]、保肝[12—13]等生物活性，其化学成分主要包括挥发油、萜类、多糖、黄酮、绿原酸类等[14]。野菊水提物对CCl4诱导的肝损伤有明显的保护效果，并能显著下调细胞色素P450 2E1(CYP2E1)蛋白水平[15]。戴胜[12]对野菊花80%乙醇提取物保肝活性成分(急性肝损伤)进行活性追踪，发现醇提物、乙酸乙酯层、正丁醇层均具有保肝活性。张晓雯等[16]发现，野菊醇提物具有抗氧化活性，其中总黄酮和总多酚对其抗氧化活性有较大贡献。这些研究揭示了野菊提取物在抗氧化、保肝等方面具有良好的生物活性，但这些研究主要集中于野菊花的活性，对茎、叶的活性和可利用价值关注较少，相关研究主要集中于茎叶多糖及其抗氧化研究[17—18]。本文主要通过自由基清除实验及酒精性肝损伤细胞模型对野菊地上部分水和乙醇提取物的抗氧化活性及保肝效果进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野菊茎、叶采样于厦门华侨亚热带植物引种园。HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH )，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，噻唑蓝( MTT) 购自 Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

主要仪器包括Thermo MK3型酶标仪、Thermo超低温冰箱、EYELA N-1100S-W 旋转蒸发仪、Christ Alpha 2-4 LD plus冷冻干燥机、Thermo二氧化碳恒温培养箱、PerkinElmer Lambda25紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备 称取野菊干粉，分别用水和95%乙醇按料液比1:20 45℃超声提取，抽滤收集滤液，减压浓缩(45 ℃)至无醇味，得到野菊水提物和醇提物浸膏。取野菊水提物和醇提物浸膏于-80 ℃超低温冰箱预冻12 h后，转至Christ冷冻干燥机冻干，得到野菊水提物和醇提物干燥粉末，密封保存于-20 ℃。

1.2.2 DPPH自由基清除测定 分别取2 mL不同浓度(50、100、200、400、800、1600 μg·mL-1)的野菊水提物、醇提物以及阳性对照 Vᴄ(5、10、15、20、25、30 μg·mL-1)待测液，加入 2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH自由基溶液，摇匀，避光30 min后，在517 nm波长处测定吸光度Ai；将DPPH自由基溶液用等体积无水乙醇代替，其他同前，测吸光度Aj；将样品用等体积无水乙醇代替，其他同前，测吸光度Ae。DPPH自由基清除率计算公式：K= [1-(Ai-Aj)/Ae]×100%。

1.2.3 ABTS自由基清除测定 取7.9 mg ABTS溶于10 mL蒸馏水中，另取1.3 mg过硫酸钾溶于10 mL蒸馏水中，混合两种溶液即得ABTS储备液，室温条件下避光储存过夜，使用时稀释4倍。分别取不同浓度野菊水提物(20、40、80、160、240 μg·mL-1)、醇提物(10、20、40、80、100、120 μg·mL-1)以及阳性对照Vᴄ(2.5、5、10、15、25、30 μg·mL-1)样品液和ABTS稀释液等量混合，在734 nm处测吸光度值；将样品液用等体积水代替，其他同前，测吸光度。ABTS自由基清除率计算公式：K′=[1-(Ai′-Ae′)/(Aj′-Ae′)]×100%，K′为清除率；Ai′为加试样反应后 ABTS 溶液的吸光度；Aj′为不加试样溶液的吸光度；Ae′为不加ABTS溶液的吸光度。

1.2.4 细胞存活率测定 96孔板接种对数生长期HepG2细胞每孔3000个，37 ℃孵育24 h，分别加入不同浓度野菊水提物(终浓度 0、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1)、醇提物(终浓度 0、8、16、32、64、128 μg·mL-1)药液，37 ℃孵育 24 h 后，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT 培养液，孵育 4 h，弃上清液，每孔加100 μL DMSO，震荡20 min后，用酶标仪在570 nm测定吸光度值。

1.2.5 野菊水提物和醇提物对酒精刺激HepG2细胞存活率测定 参考罗燕梅等[19]方法，于96孔板接种对数生长期HepG2细胞每孔3000个，37 ℃孵育24 h，分别加入不同浓度(0、5、10、20 μg·mL-1)野菊水提物、醇提物药液预处理24 h，各组加入终浓度800 mmol·L-1乙醇诱导损伤，正常对照组加入等量培养液，37 ℃孵育24 h，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT培养液，孵育4 h，弃上清液，每孔加100 μL DMSO，震荡20 min后，用酶标仪测定570 nm吸光度值。

1.2.6 数据处理 采用GraphPad Prism 6进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 野菊水提物和醇提物DPPH自由基清除能力

比较野菊水提物、醇提物与Vᴄ (阳性对照)的DPPH自由基清除能力。结果表明，DPPH自由基清除能力为 Vᴄ＞野菊醇提物＞野菊水提物(图 1)。与阳性对照组相比，野菊提取物虽然具备一定的 DPPH自由基清除能力，但明显偏弱，效果差10倍以上。Vᴄ、野菊水提物、野菊醇提物半效应浓度(EC50)分别为 19.02 μg·mL-1、452.57 μg·mL-1、194.93 μg·mL-1(表 1)。

图1 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity

2.2 野菊水提物和醇提物ABTS自由基清除能力

评价野菊水提物、醇提物和 Vᴄ(阳性对照)清除 ABTS自由基的能力。与清除DPPH自由基能力类似，ABTS自由基清除能力大小依次为Vᴄ＞野菊醇提物＞野菊水提物，但野菊醇提物对ABTS自由基清除能力明显优于对DPPH自由基的清除能力(图2)。Vᴄ、野菊水提物、野菊醇提物的EC50分别为 9.32、60.35、24.04 μg·mL-1(表 1)。

表1 野菊提取物自由基清除能力Table 1 Radical scavenging capacity of Chrysanthemum indicum extracts

图2 ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity

2.3 野菊水提物和醇提物对酒精诱导HepG2细胞损伤的影响

采用HepG2细胞模型评价野菊水提物和醇提物对酒精肝损伤的保护效果，首先对野菊水提物和醇提物的细胞毒性进行测定。结果表明，野菊水提物在500 μg·mL-1剂量浓度内对模型细胞株HepG2未呈现细胞毒性，野菊醇提物在64 μg·mL-1剂量浓度内未呈现明显的细胞毒性，在128 μg·mL-1浓度下细胞活力下降至74.20%，呈现出低细胞毒性(图3)。

图3 野菊提取物对HepG2细胞的毒性Fig.3 Cytotoxicity of Chrysanthemum indicum extracts to HepG2

在对野菊水提物和醇提物细胞毒性评价的基础上，选择无毒浓度5、10、20 μg·mL-1进行酒精肝损伤保护效果评价。结果表明，野菊提取物对乙醇诱导的 HepG2细胞损伤有明显的保护效果(图 4)。与对照组相比，模型组(eth)细胞存活率分别下降至28.96%和28.37%，而使用野菊水提物和醇提物处理的药物浓度组细胞存活率显著增加。在800 mmol·L-1酒精损伤情况下，与对照相比，野菊水提物5、10、20 μg·mL-1处理使细胞存活率分别提高 54.02%、76.86%、68.32%；野菊醇提物 5、10、20 μg·mL-1处理使细胞存活率分别提高48.79%、71.18%、76.14%。保护效果总体上呈现剂量依赖性。

图4 野菊提取物对酒精性肝损伤的保护作用Fig.4 Protective effect of Chrysanthemum indicum extracts on alcoholic liver injury

3 讨论

本文采用DPPH、ABTS自由基清除实验评价野菊茎、叶水提物和醇提物的体外抗氧化能力，并通过体外HepG2细胞模型测定野菊水提物和醇提物对酒精性肝损伤的保护作用。结果表明，野菊提取物具备一定的抗氧化活性，其中醇提物的抗氧化效果明显优于水提物，说明野菊中抗氧化成分主要集中于醇溶部位；野菊醇提物对ABTS自由基清除能力明显高于对DPPH自由基的清除能力，与张晓雯等[16,20]对野菊提取物清除DPPH、ABTS自由基能力的研究结果相似。野菊总黄酮具有良好的抗氧化活性[21]，且野菊总黄酮醇提含量高于水提含量[22]。因此，野菊水提物和醇提物的抗氧化活性及其能力差别可能归因于其中的黄酮类成分。体外酒精肝损伤细胞模型的结果表明，野菊提取物显著地提高了酒精诱导后肝细胞的存活率，在800 mmol·L-1乙醇损伤情况下，浓度为5～20 μg·mL-1的野菊水提物和醇提物均能使细胞存活率显著或极显著提高，且保肝效果总体上呈现剂量依赖性，其中醇提物的保肝效果更佳。在酒精性肝损伤的发生、发展过程中，氧化应激和脂质过氧化作用起着重要作用。野菊的保肝成分(酒精肝损伤)可能并不完全依赖其抗氧化性能，具体的保肝活性成分及保肝机制仍有待进一步研究。本文着重从体外实验模型阐明野菊茎、叶提取物的抗氧化能力和保肝活性，为后续野菊中保肝活性成分筛选和野菊地上部分的开发利用研究提供依据。