日化产品抑菌效果快速检测方法

谷爱军 于 文

（西安开米股份有限公司，陕西 西安，710075）

目前，洗涤剂抑菌性能测试方法主要为GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》、QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》和卫法监发[2002]282号 《消毒技术规范》[2002年版]。采用悬液法对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抑菌性能测定时，三种方法均需在35℃±2℃培养48h。《化妆品安全技术规范》（2015版）菌落总数的检验方法中，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL 0.5%TTC溶液[1]。笔者通过研究无色、无味的氯化三苯四氮唑（简称TTC）作为指示剂，应用在抑菌试验测试中，期望能建立快速测定日化产品抑菌效果评价的方法，以提高配方开发的效率。

1 实验试剂及设备

1.1 主要试剂

2,3,5—三苯基氯化四氮唑，又称氯化三苯基四氮唑 [triphenyltet2razolium chloride(TTC) ]、红四唑等，化学式分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2），自配；标准硬水（硬度342mg/L），自配；营养琼脂培养基，生化试剂，北京路桥技术有限公司。

试验菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希菌（ATCC 25922），中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 实验设备

恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；涡旋仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温生化培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；TYJ-2A菌落计数器，上海宏汇电器厂；生物安全柜，型号BSC-1100II A2-x，济南鑫贝西生物技术有限公司。

1.3 试验用日化产品

采购于大型超市，标贴宣称具有抑菌功能的洗手液、洗衣液、餐具净等产品。

2 实验部分

2.1 菌悬液的配制

按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希菌（ATCC 25922）五代的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬液， 要求浓度为：取0.1mL滴入5.0mL PBS液内，回收菌数在1×104～9×104cfu/mL[3]。

2.2 测试方法

按照QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》抑菌率检测方法进行测试，计算回收菌落数。

2.3 不同的灭菌方式对TTC的影响

配制0.1%TTC溶液500mL，分装于螺口玻璃瓶中。A瓶：TTC溶液单独避光高压灭菌后，吸取1.0mL，加入至已灭菌并冷却至50℃左右的100mL营养琼脂中，混合；B瓶：TTC溶液采用0.45m m微孔滤膜过滤除菌，吸取1.0mL，加入至已灭菌并冷却至50℃左右的100mL营养琼脂中，混合；C瓶：吸取1.0mL TTC溶液，于100m琼脂中混匀后121℃高压灭菌15min。

吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mL PBS的试管中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中（做适当稀释，取其中2～3个稀释度的稀释液），吸取0.5mL置于灭菌平板内，分别倾注A瓶、B瓶、C瓶及营养琼脂培养基各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300计数，各组测得的回收菌数见表1。

表1 不同的灭菌方式对TTC指示剂的影响

由表1可知：A瓶和B瓶菌落回收数，与营养琼脂对照组的相对偏差均＜10%，而C瓶外观呈现红褐色，培养的阳性菌回收菌数与对照组有明显差异。因此，本实验选择以A瓶显色培养基的制备方法，即TTC经单独高压灭菌再与50℃营养琼脂混匀的方式进行后续试验。

2.4 不同浓度TTC对阳性菌的影响

配制含TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶含TTC的浓度依次为0.01mg /mL、0.02mg /mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀；取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，吸取样液1mL置于灭菌平板内（做适当稀释后，取其中2～3个稀释度的稀释液），分别用含TTC系列梯度的营养琼脂倾注5个平皿，充分混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h，同时做不加TTC的营养琼脂对照及空白对照，以30～300 cfu/mL菌落生长数计数平板，各组测得的回收菌数见表2。

表2 含不同浓度TTC对阳性菌的影响

由表2可知：含0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC营养琼脂培养基都对大肠杆菌均无抑制现象；但对金黄色葡萄球菌显色均敏感，当TTC浓度大于0.02mg/mL时，平皿的回收菌数与营养琼脂对照组比较相对偏差略大，有一定的抑制现象，而且浓度越高，抑菌作用越明显。可能与革兰氏阳性菌细胞壁上肽聚糖和磷壁酸含量高，而革兰氏阴性菌肽聚糖和磷壁酸含量少，此外，还有脂蛋白、外膜、脂多糖等结构的不同而导致对TCC敏感性不同[4]。 最终选择0.02mg/mL的TTC作为显色剂，既保证菌落良好的显色效果，且不抑制细菌的生长。

2.5 不同色素对含0.02mg /mL TTC显色培养基的影响

试验用样品选自超市采购的洗衣液（蓝色、蓝绿色）、洗手液（蓝色、红色、绿色、白色含珠光浆、橙黄色餐具净等宣称抑菌的日化产品。测试方法按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》和QB/T 2850《抗抑菌洗涤剂》[5]进行试验。试验采用显色培养基24h与48h对照培养结果，并与营养琼脂48h对照培养进行比对。结果见表3。

由表3可知：选购市场上常见的含各种色素的日化洗涤剂产品，按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》的要求进行悬液法抑菌试验。试验在36℃±1℃培养箱内培养24h菌落已呈现红色，易于计数，比标准要求的48h培养观察缩短了时间，菌落数与48h观察结果的误差率＜10%，无明显差异。TTC显色培养基24h与营养琼脂培养基48h培养计数误差率＜10%，无明显差异。样品中所含的各种色素对TTC显色无干扰。其原理为：简称TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积，使细胞显示出相应的红色或紫色[6]。

表3 TTC显色培养基应用到带色的日化产品中的抑菌效果

3 结果与讨论

TTC最常用在种子活性测定、植物疫病检测、活组织活性检测及菌落总数的测定。通过试验发现:TTC同样适用于日化洗涤剂产品抑菌性能的测试。含0.02mg/mL的TTC显色营养琼脂培养基，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的培养均适宜，既能保证菌落良好的显色效果且不抑制细菌的生长。在24h培养即可观察出实验结果，回收的菌数与48h观察结果一致，且色素对其无影响。所以，建立快速检测日化产品抑菌效果的试验方法，可缩短检测时间，并可应用于大批量的样品抑菌效果的评价。