LC-MS／MS法同时测定复方丹参颗粒和复方丹参滴丸中6种成分

洪 艳， 文晓霞， 李 莎， 于 凯， 夏玉凤∗

（1.金鸿药业股份有限公司研究所，广东珠海 519041；2.中国药科大学中药学院，江苏南京 211198）

复方丹参方由丹参、三七、冰片配伍组成，1977年由上海中药二厂研制成功并投入生产，方中丹参为君药，所含丹参酮ⅡA、隐丹参酮等脂溶性成分具有扩张冠状动脉、提高冠脉血流、保护心肌、广谱抑菌作用，而丹参素、原儿茶醛、丹酚酸等水溶性成分具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、保护心脏微血管内皮细胞等作用[1-4］；三七为臣药，主要有效成分为皂苷，具有抗血栓形成、扩张血管、保护心肌等作用[5-7］；冰片为佐使药，引药入经，三药配伍，相辅相成，起到协同增效作用。

复方丹参方主要用于治疗冠心病心绞痛，在临床上因其疗效确切，不良反应少，而被开发成多种剂型，如2015版 《中国药典》就收载有复方丹参丸、片、胶囊、喷雾剂 （气雾剂）、颗粒、滴丸6种剂型[8］，其药物组成、功能主治均相同，但处方中各药用量、生产工艺、质量标准等有所差异，其中复方丹参滴丸因服用方便、起效迅速而成为治疗冠心病心绞痛的急救药品，其药效物质基础及作用机制值得探讨。目前，有关复方丹参片与滴丸的质量分析、药理作用等方面的报道较多[9-11］，而复方丹参颗粒是通过新型辅料及新工艺制成的颗粒剂，具有溶散时间短、释放速度快、防湿性能强、质量稳定、服用方便等特点，具有较好的市场应用前景，但相关研究较少。因此，本实验建立LCMS／MS法同时测定复方丹参颗粒和复方丹参滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA的含有量，以期为进一步比较两者作用特点提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 LC System、Agilent 6420 Triple Quad LC／MS （美国 Agilent公司）；SB-5200DT超声波清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；Sartorius BT25S电子天平；Direct-Q超纯水系统 （美国Millipore公司）；TGL-16M高速台式冷冻离心机 （湖南湘仪仪器有限公司）。

1.2 试药 丹参素钠 （批号110855-201614）、三七皂苷 R1（批号 110745-201619）、人参皂苷 Re（批号 110754-201626）、人参皂苷 Rg1（批号110703-201731）、人参皂苷 Rb1（批号 110704-201625）、丹参酮ⅡA（批号110766-201721）对照品均购自中国食品药品检定研究院。复方丹参颗粒（金鸿药业股份有限公司，批号170509、170506、170422）；复方丹参滴丸 （天津天士力制药股份有限公司，批号170421、161115、160531）。乙腈为色谱纯 （德国默克公司）；甲醇为色谱纯 （江苏汉邦科技有限公司）；甲酸为色谱纯 （上海克拉玛尔试剂）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Eclipse Plus C18色谱柱 （3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相乙腈 （A） -0.1%甲酸（B）， 梯度洗脱 （0～1 min， 10%A； 1～2 min，10%～20%A；2～10 min，20% ～40%A；10～15 min， 40%A； 15～16 min， 40% ～98%A； 16～26 min，98%A，再运行 6 min）；体积流量0.3 mL／min； 进样量 5 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾电离源 （ESI），正、负离子快速切换多重反应监测模式 （MRM）检测，0～21 min为负离子模式，21～26 min为正离子模式；干燥气体N2，温度350℃，体积流量9 L／min；雾化器压力35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；毛细管电压5 000 V（正离子模式）、4 000 V （负离子模式）。质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 精密称取丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA对照品适量，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得贮备液。分别精密量取适量于2 mL量瓶中，甲醇-0.1%甲酸 （50∶50）稀释至刻度，摇匀，即得（质量浓度分别为3 335.40、 2 888.00、 2 922.00、 1 834.56、 2 793.00、183.08 ng／mL）。

2.4 供试品溶液制备 取颗粒、滴丸适量，研钵中充分碾磨均匀，分别精密称取约10 mg，置于具塞棕色瓶中，加入25 mL 75%甲醇，称定质量，超声30 min，放冷，75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，两者续滤液加入甲醇-0.1%甲酸（50∶50） 分别稀释 10、 2倍， 12 000 r／min离心10 min，取上清液，即得。

2.5 专属性考察 吸取甲醇空白对照、对照品、供试品溶液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分峰形良好，阴性无干扰。

图1 各成分LC-MS／MS色谱图Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取 “2.3”项下对照品溶液适量，甲醇-0.1%甲酸 （50∶50）稀释成系列质量浓度，在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，再分别以信噪比 S／N＝10、S／N＝3时的质量浓度作为定量限和检测限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 将同一对照品溶液在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定6次，测得丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1、丹参酮ⅡA峰面积 RSD分别为0.41%、1.88%、2.42%、1.32%、1.76%、1.95%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液 （颗粒批号170509，滴丸批号170421），于室温下放置0、1、2、3、4、6 h后在 “2.1” 和 “2.2” 项条件下进样测定，测得颗粒和滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA峰面积 RSD分别为1.52%、4.91%、4.77%、 2.56%、 4.52%、 1.50% 和 2.02%、4.34%、4.78%、3.39%、4.11%、2.05%，表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批颗粒 （批号170509）和滴丸 （批号170421），按 “2.4”项下方法制备供试品溶液6份，在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定，测得颗粒和滴丸中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA含有量 RSD分别为2.33%、4.83%、5.00%、 2.40%、 4.71%、 2.53% 和 1.45%、3.81%、4.83%、1.89%、5.01%、4.15%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒 （批号 170509）和滴丸 （批号 170421） 各5 mg，精密加入500 μL对照品溶液，平行6份，按 “2.4”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”和 “2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，颗粒中丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA平均加样回收率分别为 96.64%、100.67%、98.79%、105.74%、99.18%、99.53%，RSD分别为 2.19%、 4.41%、 4.23%、 1.86%、 1.94%、4.88%；滴丸中各成分平均加样回收率分别为95.76%、98.95%、103.10%、102.25%、101.66%、104.59%，RSD分别为 2.18%、4.76%、3.72%、1.96%、4.45%、1.99%。

2.11 样品含有量测定 取不同批号颗粒、滴丸各3批，按 “2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和 “2.2”项条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果 （mg／g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 提取溶剂选择 本实验考察了不同体积分数甲醇 （25%、50%、75%、100%）对6种成分提取率的影响，发现25%、50%甲醇提取时，丹参酮ⅡA提取率较低；甲醇提取时，丹参素钠提取率减少，并与75%甲醇提取时存在显著差异；75%甲醇提取时，各成分提取率均较高，故选择其作为提取溶剂。

3.2 色谱条件优化 本实验比较了不同型号、粒径的色谱柱，发现Eclipse Plus C18色谱柱 （3.0 mm×150 mm，3.5 μm）分离效果较好。再考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸 （含 10 mmol／L醋酸铵）、乙腈-0.1%甲酸等体系，发现在乙腈-0.1%甲酸条件下各成分响应更好，故选择其作为流动相。

3.3 质谱条件优化 由于各成分性质差异较大，故本实验通过离子检测模式对其进行考察，发现丹参素钠、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1在负离子模式下响应较好，而丹参酮ⅡA在正离子模式下响应较好。为了使上述成分均有最高的灵敏度，本实验采用正负离子切换模式，从而确保它们均能在各自最佳电离模式下进行检测。

3.4 含有量分析 表3显示，除丹参素钠在复方丹参颗粒中含有量较低外，其他5种成分含有量均高于复方丹参滴丸。复方丹参颗粒和复方丹参滴丸是同一方剂衍生出的不同剂型，其功能主治相同，均为活血化瘀、理气止痛，但两者有效成分含有量差异较大，这将影响临床疗效。中药复方发挥疗效具有多成分、多靶点协同作用的特点，是一个复杂的体内过程，故药物作用强度除了与制剂中主要有效成分含有量密切相关外，有效成分作用方式、生物利用度、不同剂型对其体内吸收的影响等因素也将影响疗效。目前，针对复方丹参滴丸体内吸收特点有一些探索性研究[12-14］，但鲜有复方丹参颗粒中有效成分药代动力学、作用机制及与剂型间关系的报道，本实验可为后期对该制剂进一步研究提供有价值的信息。