大孔吸附树脂分离纯化油橄榄叶总黄酮

李 俊， 刘孟源， 方升平， 王维香

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

油橄榄又名洋橄榄、齐敦果，是以 “高产、优质、高效”为特征的世界名贵常绿木本油料和果用树种[1］，国外学者已从中分离得到100多个化合物，其中油橄榄叶中含有的抗氧化活性成分较果实更突出，主要为多酚类[2-4］。研究表明，油橄榄叶提取物有着降血脂、降血糖、降血压作用，并且可预防老年痴呆和癌症，治疗胆结石，抑制病毒和细菌[5-7］，同时具有很强的抗氧化活性，可取代化学防腐剂用于食品保鲜[8-11］，国外已将其广泛用于化妆品、食品和药品。油橄榄叶多酚类成分的分离提取技术包括有机溶剂萃取[6］、超声辅助浸提[12-13］、 微波辅助浸提[14］、 超临界流体萃取[15］、吸附法[16］等，其中吸附法对酚类／多酚类物质的分离浓缩有明显优势[17］。

油橄榄引入我国后受到政府大力扶持，已经初具规模，特别是四川、云南、甘肃等地已经出现较具规模的大型基地，但仅利用了其果实，而大量叶被废弃，造成资源浪费，目前回收利用该部位叶中的活性成分越来越受到重视[18-21］。因此，本实验比较9种大孔吸附树脂对油橄榄叶中总黄酮的吸附、解吸、动力学特性，从中筛选出选择性好、吸附率高、易解吸的树脂，同时优化其吸附与解吸条件，为提高其质量提供指导意义。

1 材料

油橄榄叶采自凉山州会理县丰达生态农业有限公司油橄榄种植基地，经西华大学食品与生物工程学院杨文宇副教授鉴定为木犀科木犀榄属常绿乔木油橄榄Olea europaea L.的叶，将其自然晾干粉碎后过100目筛，40℃下干燥至恒定质量。UV-2600紫外可见分光光度计 （上海尤尼柯仪器有限公司）；RE-52B真空旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）；TDL-40B台式低速离心机 （湖南星科科技仪器有限公司）；ST-02A多功能粉碎机 （永康市帅通工具有限公司）；层析柱 （上海嘉鹏科技有限公司）；BS-100A自动分部收集器、HL-2恒流泵 （上海沪西分析仪器厂）。大孔吸附树脂基本信息见表1。芦丁对照品 （上海试剂二厂）；其他试剂均为分析纯 （成都市科龙化工试剂厂）。

表1 大孔吸附树脂基本信息Tab.1 Basic information of macroporous adsorption resins

2 方法

2.1 标准曲线绘制[4］以芦丁对照品质量浓度为横坐标 （X），吸光度为纵坐标 （A）进行回归，得到回归方程为A＝0.735 2X-0.001 9，在0.09～1.075 mg／mL范围内线性关系良好。

2.2 总黄酮质量浓度测定 称取干燥至恒定质量的油橄榄叶144.8 g，1 L 70%乙醇在80℃下水浴提取2 h，4 000 r／min离心10 min，收集上清液，同法提取残渣，合并2次上清液，40℃、50 r／min下浓缩至 870 mL，加入 0.4%壳聚糖醋酸溶液100 mL，过滤，滤液用70%乙醇稀释至2 180 mL，测定总黄酮质量浓度。

2.3 大孔吸附树脂筛选[22-25］

2.3.1 预处理 非极性树脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，95%乙醇冲洗至洗出液加适量蒸馏水无白色浑浊，再用双蒸水洗至无醇味；阴离子交换树脂用1 mol／L HCl浸泡2～3 h后，蒸馏水洗至近中性，再用1 mol／L NaOH浸泡2～3 h后蒸馏水洗至近中性；D296树脂依次用丙酮和乙醇浸泡24 h，再用双蒸水洗至无醇味。

2.3.2 静态饱和吸附量测定 称取预处理后的树脂各1.000 g，加入 100 mL样液，室温下振荡24 h，于1、2、4、6、8、24 h取1 mL上清液测定总黄酮含有量，计算树脂对总黄酮的饱和吸附量，公式为饱和吸附量＝ （C0-Ct）Vy／Ws， 其中 C0为吸附前样品溶液中总黄酮质量浓度，Ct为吸附后样品溶液中总黄酮质量浓度，Vy为样品溶液体积，Ws为树脂质量。

2.3.3 静态解吸率测定 将吸附饱和的树脂置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL 70%乙醇振荡6 h后静置24 h，取1 mL上清液，测定解吸液中总黄酮含有量，计算树脂静态解吸率，公式为解吸率＝[（CjVj） ／（QWs）]×100%， 其中， Cj为解吸后上清液中总黄酮质量浓度，Vj为解吸后上清液体积，Ws为树脂质量，Q为树脂静态饱和吸附量。

2.4 HPD-300型大孔吸附树脂吸附总黄酮的条件

2.4.1 正交试验 在预试验基础上，选择总黄酮质量浓度 （A）、上样液体积流量 （B）、上样液pH值 （C）、洗脱液体积流量 （D）作为影响因素，每个因素3个水平，通过L9（34）表进行设计。因素水平见表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

然后，取25 mL树脂装柱，层析柱径高比1∶10，油橄榄叶提取液上柱量16 BV，70%乙醇洗脱，收集洗脱液，每组200 mL，测定总黄酮含有量，计算树脂动态吸附率，公式为吸附率＝[ （C0Vy-CiVi） ／（C0Vy）]×100%， 其中C0为上样液中总黄酮质量浓度，Vy为上样液体积，Cl为流出液中黄酮质量浓度，Vl为流出液体积。

2.4.2 吸附泄漏曲线考察 条件为上柱液总黄酮质量浓度3.25 mg／mL，pH值5.0，上柱体积流量2 BV／h，层析柱径高比 1∶10，收集流出液，1 BV／管，测定每管收集液中总黄酮质量浓度，绘制吸附泄漏曲线。

3 结果

3.1 总黄酮质量浓度测定 表3显示，总黄酮平均质量浓度为1.945 mg／mL。从144.8 g干燥油橄榄叶中提取分离出的总黄酮质量为4.24 g，油橄榄叶中总黄酮得率为2.93%。

表3 总黄酮质量浓度测定结果Tab.3 Results of concentration determination of total flavonoids

3.2 大孔吸附树脂筛选 表4显示，强极性树脂D296、S-8对总黄酮的吸附作用较好，但解吸率极低；弱极性树脂AB-8、S-8虽然有较大的比表面积，但吸附量和解吸率都较低；非极性树脂LS-8比表面积较小，吸附性能较差；非极性树脂HPD-300、D140比表面积较大，孔径较小，对总黄酮的吸附性很强，解吸率也较高，尤其是前者有更大的比表面积，吸附作用更强。另外，总黄酮在强极性树脂上具有很强的吸附能力，但解吸难，而在非极性或弱极性树脂上有更好的吸附效果，故本实验选择非极性树脂HPD-300进行后续研究。

表4 大孔吸附树脂吸附量、解吸率Tab.4 Adsorption quantities and desorption rates of macroporous adsorption resins

3.3 吸附总黄酮条件

3.3.1 动态吸附 表5～6显示，各因素影响程度依次为A＞C＞B＞D，最优工艺为A1B3C3D3，即径高比1∶10，上样液质量浓度3.25 mg／mL，体积流量2 BV／h，pH值5.0，体积16 BV，洗脱液体积流量1 BV／h，总黄酮吸附率最高，为83.5%。另外，低质量浓度下总黄酮不利于吸附，当上样液质量浓度为3.25 mg／mL时其吸附率最大，超过该质量浓度后反而下降，可能产生泄漏，导致处理量下降。

表5 试验设计及结果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

3.3.2 吸附泄漏曲线 图1显示，上样液体积在5 BV后开始泄漏，到16 BV时泄漏液中总黄酮质量浓度为 3.20 mg／mL，接近上样液质量浓度（3.25 mg／mL），可认为树脂柱吸附量达到饱和。因此，确定最大上样液体积为16 BV左右。

图1 总黄酮吸附泄露曲线Fig.1 Adsorption leakage curve for total flavonoids

3.3.3 吸附洗脱曲线 图2显示，洗脱曲线峰型集中，无明显拖尾现象，总黄酮洗脱集中出现在1～5 BV区域，以此为富集段，测得总黄酮洗脱率为94%，富集率为346.7%，即是原来的3.47倍。

图2 总黄酮吸附洗脱曲线Fig.2 Adsorption elution curve for total flavonoids

3.3.4 验证试验 采用 “3.3.1”项下最优工艺进行3次验证试验，结果见表7。由表可知，经过树脂纯化后可去除大量杂质，从而提高总黄酮量。

表7 验证试验结果 （n＝3）Tab.7 Results of verification tests（n＝3）

4 结论

本实验通过测定9种大孔吸附树脂对油橄榄叶总黄酮的吸附特性，综合比较吸附量、解吸率、解吸物中总黄酮质量浓度。结果，非极性树脂HPD-300对总黄酮的分离纯化效果最佳，故确定其作为最佳吸附树脂。最佳纯化工艺为树脂柱径高比1∶10，总黄酮质量浓度 3.25 mg／mL，上样体积16 BV，体积流量2 BV／h，蒸馏水洗脱3 BV后再用8 BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，此时总黄酮吸附率为83.5%，洗脱率为94%，富集率为346.7%，制得产品中其得率为10.19%，质量分数为87.38%，回收率为80.74%。