HPLC法同时测定陈香露白露片中4种成分

胡昭君， 陈 斌， 余岳林， 张少敏

（上海市静安区食品药品检验所，上海 200435）

陈香露白露片由甘草、次硝酸铋、陈皮、碳酸镁、川木香、氧化镁、大黄、碳酸氢钠、石菖蒲组成，功效健胃和中、理气止痛，主要用于胃酸过多、慢性胃炎引起的胃脘痛等症状。目前，陈香露白露片质量标准[1］中的含有量测定仅针对化药次硝酸铋，尚未涉及甘草、陈皮等中药成分；前期报道有测定次硝酸铋中铋含有量的[2］，测定陈皮中橙皮苷含有量的[3-6］，测定甘草中甘草酸铵、甘草次酸含有量的[7-8］，分别测定陈皮中橙皮苷、甘草中甘草酸铵含有量的[9］，但对其他中药成分含有量测定均无报道。陈香露白露片中甘草有补中益气、缓急止痛、清热解毒的作用[10］，主要成分为甘草酸铵；陈皮有理气健脾、燥湿化痰的作用[11］，主要成分为橙皮苷；川木香在治疗胃肠道疾病方面有比较好的疗效，其主要活性成分为木香烃内酯和去氢木香内酯[12］。本实验通过HPLC法同时测定陈香露白露片中甘草酸铵、橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯的含有量，方法快速简便，稳定可靠，可更有效地控制该制剂内在质量，并为保证其临床用药安全提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters E2695高效液相色谱仪，配置真空脱气机、四元泵、自动进样系统、柱温箱、二极阵列管检测器、色谱工作站 （美国 Waters公司）；Branson B55000S-MT超声波清洗器 （上海必能信超声有限公司）；ME-235S／CP124S电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药 橙皮苷 （110721-201617， 含有量96.1%）、 甘草酸铵 （110731-201619， 含有量93.0%）、木香烃内酯 （111524-201710， 含有量99.5%）、去氢木香内酯 （111525-201711，含有量99.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯 （德国Merck公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。5批陈香露白露片均购自药店，来自5家生产企业 （批号170105、20170502、161201、 160411、 A161260）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取对照品橙皮苷9.83 mg、甘草酸铵19.34 mg、木香烃内酯9.50 mg、去氢木香内酯9.37 mg，置于4个50 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取4种贮备液5、2、1、1 mL置于同一20 mL量瓶中，50%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液 取质量差异项下片剂研匀，精密称取约0.5 g，置于50 mL量瓶中，加适量50%甲醇超声提取30 min，取出，放冷，50%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例及工艺，分别制备缺陈皮、甘草、川木香的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备相应溶液，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 Agilent Eclipse C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相甲醇 （A） -0.1%磷酸 （B）， 梯度洗脱 （0～20 min，70%～60%B； 20～30 min， 60% ～40%B； 30～50 min， 40% ～30%B； 50～51 min， 30% ～10%B；51～56 min， 10%B； 56～57 min， 10% ～70%B；57～67 min， 70%B）； 体积流量 1.0 mL／min； 柱温30℃；检测波长230 nm；进样量20 μL。理论塔板数按橙皮苷计均大于8 000，各成分色谱峰与相邻峰的分离度均大于3.0。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，供试品在对照品相同保留时间处有色谱峰，阴性无干扰，待测成分与其他成分分离度良好。

2.4 线性关系考察 精密称取橙皮苷对照品20.62 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，作为橙皮苷对照品贮备液；精密称取甘草酸铵对照品19.80 mg、木香烃内酯对照品11.38 mg、去氢木香内酯对照品10.76 mg，置于同一20 mL量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，作为混合对照品贮备液。分别精密量取前一种对照品贮备液2.5、5、10、15、30 mL，后一种对照品贮备液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为相应对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样20 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标 （X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取供试品溶液 （批号170105）1份，在 “2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得橙皮苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积 RSD分别为 0.31%、0.38%、0.32%、1.07%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号 （170105）片剂，按 “2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯含有量RSD分别为1.07%、0.84%、1.23%、0.61%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液 （批号170105）1 份， 于 0、 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、36 h在 “2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积RSD分别为0.60%、0.53%、0.79%、0.36%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取橙皮苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，50%甲醇稀释，制成每1 mL分别含上述对照品0.188 9、0.047 56、 0.041 16、 0.041 60 mg／mL的对照品溶液。精密称取 “2.6”项下含有量已知的片剂 （批号170105）0.25 g，共9份，置于50 mL量瓶中，精密加入对照品溶液4、5、6 mL，再加入适量50%甲醇，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.9 样品含有量测定 取5批片剂，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表3。

3 讨论

3.1 流动相选择 参照2015年版 《中国药典》中陈皮、甘草、川木香含有量测定条件，本实验考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，发现各成分色谱峰峰形在甲醇-0.1%磷酸中较好，而且与相邻杂质峰的分离度均能达到要求，故选择其作为流动相。

表2 各成分加样回收率试验结果 （n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

3.2 检测波长选择 本实验采用二极管阵列检测器，在190～380 nm波长范围内进行扫描，发现橙皮苷在194、284、328 nm附近有最大吸收，而且在230 nm处有1个肩峰，其吸收值高于 284、328 nm；甘草酸铵在194、251 nm附近有最大吸收，而且在250 nm处呈肩峰；木香烃内酯和去氢木香内酯在194 nm附近有最大吸收，而且其吸收值随着波长增加呈下降趋势，300 nm以上基本无吸收，考虑到194 nm为末端吸收，溶剂及杂质干扰会比较大，而在230、251 nm附近4种成分都会有一定吸收，故选择230、251 nm作为检测波长。然后，考察各成分响应值及杂质对测定的干扰，发现在230 nm波长处各成分响应值均较高，与杂质峰分离良好；在251 nm处木香烃内酯、去氢木香内酯响应值太低。最终，选择230 nm作为检测波长。

3.3 提取条件选择 本实验考察以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、稀乙醇为溶剂超声30 min的提取效果，发现溶于50%甲醇时不仅各成分峰形良好，而且杂质对目标成分测定基本无干扰，故选择50%甲醇作为溶剂。再考察超声30 min、加热回流30 min、室温浸渍过夜的提取效果，发现室温浸渍过夜时提取率最低，而加热回流提取率略高于超声，但杂质明显更多，甚至有1个已经干扰到目标成分测定，故选择超声作为提取方法。然后，考察超声15、30、45、60 min时的提取率，发现提取45、60 min时的提取率接近30 min，高于15 min，故选择30 min作为提取时间。

3.4 含有量分析 表3显示，5批陈香露白露片中4种成分含有量存在显著差异，以木香成分木香烃内酯、去氢木香内酯最明显，RSD分别高达64.1%、83.3%，而陈皮成分橙皮苷RSD也高达33.2%。由于陈香露白露片中各药材均以原粉入药，故推测上述现象可能是投料用饮片质量参差不齐所致，为了保证该制剂临床用药安全有效，需要对其中所含成分的含有量进行监控。