核酸检测法与酶联免疫吸附法在乙型肝炎病毒血清学检验中的应用分析

毕玉超* 王 吉 任 莹 陈慧博

（1 朝阳市中心血站，辽宁 朝阳 122000；2 吉林大学第二医院，吉林 长春 130062）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是危害人类健康的主要病原体之一，也是经血液传播的主要病原体之一。它具有发病率高、潜伏期长、携带率高等特点。我国是HBV流行的高发地区，人群携带率约为10%，这已成为了我国严重的公共卫生问题之一[1]。目前，检测HBV感染最常用的指标是对血清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的检测。实验室常用的检出方法是酶联免疫吸附法（ELISA），它可以大大降低输血感染HBV的风险，但由于有HBV“窗口期”和隐匿性HBV感染的存在，被输血者仍有感染HBV的风险存在。核酸检测PCR（nucleic acid test PCR，NAT PCR）是融合了PCR和DNA探针的杂交技术，采用荧光技术和闭管检测，直接检测PCR过程中的荧光信号变化[2-3]。将它应用到HBV的检测中，对血液标本中的HBV-DNA进行检测。本文探讨了NAT PCR与酶联免疫吸附法（ELISA）在乙型肝炎病毒血清学检验中的应用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源：朝阳市中心血站2017 年1月1日至2017年12月31日期间检测的无偿献血者血液样本。核酸标本现场离心分离出血浆，样本采用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝真空采血管采集。采用5 mL普通抗凝管（江苏康健公司）用于ELISA法检测，5 mL核酸分离胶管（上海力因精准医疗）用于NAT PCR法检测，将样本置于2～8 ℃冰箱中储存。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 酶联免疫检测法：试剂采用英科新创和珠海丽珠两个厂家的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒进行两遍检测。设备采用全自动样本处理系统Freedom EVO Clinical（瑞士帝肯公司）进行样本处理，全自动酶免分析系统Microlab FAME24/20（烟台澳斯邦生物）进行酶免分析处理。

1.2.2 核酸检测法：试剂采用上海浩源生物科技生产的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）进行血液标本的HBV DNA的筛查检测。设备采用ChiTas BSS 1200检测分析系统进行样本汇集、核酸提取、PCR创建。ABI 7500进行扩增检测。

1.3 方法

1.3.1 酶联免疫检测：采用不同人员使用不同仪器、试剂分别进行HBsAg项目的检测。本站HBsAg项目设置灰区为0.7，即s/co值＜0.7为无反应性，s/co值≥0.7为反应性。双试剂均无反应性判定为合格，双试剂反应性判定为不合格，单试剂反应性判定为待查。待查标本采用有反应性的试剂进行双孔复试。复试两孔均无反应性判定为合格，复试两孔中有任一孔为反应性则判定为不合格。

1.3.2 核酸检测法：采用上海浩源系统对酶免检测合格的标本进行8人份混样检测。对HBsAg项不合格标本进行单检。根据Ct值（指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）进行结果的判定。Ct值＞45为无反应性，Ct值≤45为反应性。混检结果无反应性判定为合格，混检有反应性需要进行拆分检测（单检），拆分无反应性判定为合格，拆分反应性判定为不合格。单检无反应性判定为合格单检有反应性判定为不合格。

1.4 统计学处理：应用SPSS18.0软件进行数据统计分析，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清学检测结果：本研究使用两种不同品牌的ELISA试剂盒对2017年的全部无偿献血者血清标本27855份进行检测，其中不合格标本数（率）为370份（1.33%），其中HBsAg不合格数（率）为52份（0.19%）。

2.2 HBV的NAT PCR与ELISA的检测结果比较：利用NAT PCR对2017年全部血清标本进行检测，结果如表1所示， HBV-DNA检测不合格标本数为64份（0.23%）。对NAT PCR与ELISA检测HBV的结果进行比较，两种检测方法的差异具有统计学意义（χ2=16929.58，P＜0.05）。

表1 辽宁省朝阳市2017年血液标本NAT PCR法与ELISA法对HBV检测结果比较

3 讨 论

目前在临床上，ELISA仍然是检测HBV血清学标志物的主要方法，该方法灵敏度可达（0.05～0.5）ng/mL[4]，它还具有操作简便、检测迅速、价格低廉等特点[5]，而被广泛应用在无偿献血的筛查工作中。采用该法对血液标本进行筛查后，输血传播HBV的风险已得到了明显控制。但由于有HBV“窗口期”和隐匿性HBV感染的存在，以及其检验结果中假阴性和假阳性结果的存在[6-8]，使被输血者仍有感染输血后HBV的风险存在。随着核酸检测技术的发展，NAT PCR法以其灵敏度高，特异性好及窗口期短的特点，在血液筛查工作中应用越来越广泛。

本研究发现在辽宁省朝阳市2017年27855份血液标本中，经ELISA检测为阳性的标本数为52份（0.19%），经NAT PCR检测为阳性的标本数为64份（0.23%），两种检测方法经方差分析差异具有统计学意义。这说明只用ELISA检测的HBsAg可能不能完全反应HBV病毒在血液中的存在情况。它需要NAT PCR法进行复检，以确保检测结果的准确性。虽然，NAT PCR法存在着检测费用高，需要特殊的仪器设备的问题，使它不能完全取代血清学标志物的地位，但它能更准确的反应HBV的感染情况。

综上所述，将ELISA与NAT PCR法联合使用，可以有效的提高检测的灵敏度，进而提高输血的安全系数,这也与其他文献报道相一致[9-10]。