中草药治疗水霉病的配比研究

刘云鹏，刘帛屿，赵 阳，王丽敏

(河北农业大学，河北 沧州 061100)

水霉病是出现在淡水养殖过程中的一种真菌性疾病。水霉菌感染体表受伤组织和死卵，在其表面形成一层灰白色棉絮状覆盖物，又叫水棉病或者覆霉病，还称作白毛病或者肤霉病[1]。到目前为止，已经发现了十几种水霉病的病原，其中发病率最高的是水霉和绵霉。水霉病是目前一种很难治愈的疾病。现在市场上出售的治疗水霉病的药物大部分是以化学药物为主要成分，如福尔马林、亚甲基蓝、碘等。福尔马林在病发的早、中、晚期都具有不错的效果，但是其毒性较大，会对鱼体造成一定程度的损伤，其他普通化学药物只在早期具有一定效果，在中期及晚期效果甚微。与这些化学药物相比，中草药生长于自然环境，选用一些具有杀菌效果的中草药进行配比制药，具有副作用小、药物残留极低、药物成本适中、药效持续时间长等诸多优点，有着广泛的开发前景，实践意义重大。

研究发现，中草药成分复杂，活性成分种类繁多，已经发现300多种中草药对抑制真菌有效果。但是考虑到中草药抑菌药理复杂，可能有的中草药单个使用效果不明显，与其他药物配合使用之后，又发挥出不同的药效。大黄、苦参、五倍子三种中草药中，含有较高的生物碱类、甙类和鞣酸等抑制真菌的有效成分，因此本实验选择这三种中草药进行治疗水霉病的试验。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大黄500 g、五倍子500 g、苦参500 g、蒸馏水若干桶、新鲜马铃薯1 000 g、瓶装琼脂500 g、瓶装葡萄糖500 g、水霉孢子一瓶。

1.2 试验仪器

洁净工作台、电热恒温培养箱、生物显微镜、电热恒温水浴锅、离心机、抽滤机、电炉、高压灭菌锅、500 mL烧杯、1 L大烧杯、200 μL移液枪、10 mL圆底连盖离心管、研钵、2 500 mL锥形瓶、冰箱、血球计数板、打孔器、布氏漏斗、电子天平等。

1.3 实验方法

1.3.1 水霉培养基的制作 参考文冰的实验[2]选用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

选取新鲜马铃薯，称量250 g，清洗干净，去掉表皮，切成边长为1 cm小碎方块，放入大烧杯中加入蒸馏水至1 000 mL，加热，小火煮沸持续30 min，制成马铃薯浆液，冷却[3]，过滤。准备1 000 mL锥形瓶，加入850 mL马铃薯汁、17 g浓度2%葡萄糖、17 g琼脂，搅拌混匀，使其完全溶解，煮沸。冷却，再次加热，反复三次[4]。用脱脂棉将锥形瓶口封好，牛皮纸包裹，将培养液与实验用具一并放入高压灭菌锅中灭菌，121 ℃，灭菌30 min[5]。取出灭菌后的培养基，稍冷却，倒平板。待平板中的培养基完全冷却凝固后，移至25 ℃恒温培养箱中倒置保存24 h，检查培养基是否被杂菌污染[6]。将无污染培养基移至4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 选择水霉孢子 取出水霉孢子，进行验活及接种实验。先将实验用具紫外线杀菌20 min，再将孢子水和下层匀浆倒入平板，涂布，此步骤制作两个接种培养基，便于对比观察。将已接种好的菌落移至27 ℃恒温培养箱内培养2～4 d。若发现水霉菌长势良好，则可以进行水霉孢子的分离。轻轻刮下培养基上的水霉孢子和水霉菌丝，加入少许蒸馏水一同放入研钵中充分研磨[7]。将研磨好的水霉孢子匀浆倒入离心管中，离心，2 200 rmp，10 min。取适量上清液，使用血球计数板计算水霉孢子数。再使水霉孢子和水霉菌丝同上清液混合，用100目筛绢充分反复过滤，使用生物显微镜观察滤液中水霉孢子数，计算出孢子浓度为4×105cuf/mL，孢子数符合要求，可以继续实验(当水霉孢子数在3×105～5×105cuf/mL时即可以使用)[8]。

1.3.3 中草药药物混合 用电子天平称取大黄、苦参、五倍子各5 g，分别放入500 mL烧杯中，按照中草药和水1∶70的比例[9]，分别加入蒸馏水350 mL，用纱布盖上烧杯口浸泡24 h，加热，待水沸腾后，小火熬制45 min，期间不停止搅拌。用纱布将药液滤出，之后抽滤，再加热浓缩，直至剩余20 mL，此时药液浓度为2.5 mg/mL。稀释原药液至浓度为1.0、0.5、0.3 mg/mL。此时制作出的每种药液分别有1.0、0.5、0.3 mg/mL三种浓度。将药液进行消毒灭菌。

以一种中草药为变量，另外两种中草药保持0.5 mg/mL的浓度且恒定，将作为变量的中草药设置出三个浓度梯度，如此配成组合(见表1)，分别标记出序号。实验时全部设置三组平行实验。

1.3.4 培养水霉孢子 首先，用移液枪吸取750 μL水霉孢子液，在培养基上涂布；再用孔径为0.6 mm打孔器在培养基上均匀打三个孔[10]，进行三组平行实验。分别用标签纸标记好实验序号I至IX，贴在培养基的底部。最后，用移液枪按照表1进行药液注入，吸取三种药液各50 μL注射到同一小孔内，三个孔打入相同种类、相同剂量的药液。将培养基移至24 ℃培养箱内2～4 d，记下数据。

表1 三种中草药的不同配比方案(mg/mL)

最后对筛选出的药物进行验证分析。原理如下：三种不同浓度中草药的配比试验结果记录之后，只能证明三种中草药的各自使用浓度效果，不能表现出最佳的配比组合，将各自最佳浓度进行单方实验和混合实验之后，通过对比，确定出实验结果，进行生产试验。

2 实验结果

实验结果见表2-表5。

表2 大黄抑菌圈结果(mm)

表3 苦参抑菌圈结果(mm)

表4 五倍子抑菌圈结果(mm)

表5 三种中草药不同配比的抑菌圈结果(mm)

分别将0.3 mg/mL大黄、1 mg/mL苦参、1 mg/mL五倍子进行单方抑菌试验[11]。取制作好的培养基，吸取750 μL的水霉孢子液接种，涂布，接着用打孔器在培养基上均匀打三个孔[12]，分别吸取150 μL 0.3 mg/mL大黄药液注入到小孔中，设置三个平行实验组。苦参、五倍子实验分组同理。再分别取0.3 mg/mL大黄+1 mg/mL苦参+1 mg/mL五倍子(药物含量)各1 mL进行混合(记为组合X)，做抑菌试验，设置三个平行实验组，操作方法同上所述，在24 ℃恒温培养箱中培养2～4 d。记录结果(见表6)。

表6 三种中草药在各自最佳浓度下

3 分析与讨论

根据表2、3、4数据分析，三种中草药在不同浓度下，抑菌效果也不同，存在较大差异。

根据表2可知，大黄在浓度为1.0 mg/mL时，抑菌圈大小分别为7.5、7.0和5.5 mm，基本无抑菌效果；在浓度为0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的情况下，两个试验起到较好的抑菌作用；尤其在浓度为0.3 mg/mL时，抑菌圈直径平均数据为14 mm，可以看出，在设置的浓度梯度中0.3 mg/mL抑菌能力最强。

根据表3可知，苦参的浓度为0.3 mg/mL时，数据为7.5、7.5和14.0 mm，抑菌程度较轻；在浓度为0.5 mg/mL时，记录结果是19.0、17.0和16.5 mm，平均值是17.5 mm，参考孔径大小，有一定抑菌作用；当苦参浓度为1.0 mg/mL时，对水霉孢子的抑菌效果最好，平均值是19.5 mm，结果表明，苦参的浓度与抑菌效果成正相关。

根据表4可知，五倍子浓度为1 mg/mL时，抑菌圈平均直径为18 mm，三组均表现出明显的抑菌作用；五倍子浓度为0.5 mg/mL时，抑菌圈直径为12.2 mm，有一定的抑菌效果；五倍子浓度为0.3 mg/mL时，抑菌圈大小为12.0 mm，三个浓度组全部表现出抑菌效果，表明五倍子浓度与抑菌效果呈正比。在三种浓度下均有抑菌效果，浓度为1 mg/mL时作用最强，最大抑菌圈为20 mm，平均抑菌圈为18 mm。

三种药物的用量和效果之间的关系各有不同，在本试验设置的浓度梯度范围内显示，有的抑菌圈和药物浓度成正相关，中草药液的浓度高，对水霉菌抑制作用就好，如五倍子和苦参，其中五倍子的三种浓度均有抑菌效果；也有的药液浓度与抑菌效果成负相关，如大黄，当大黄浓度为0.3 mg/mL时抑菌效果是最好的。结合以上分析并根据表5数据总结出，当大黄浓度为0.3 mg/mL、苦参浓度为1.0 mg/mL、五倍子浓度为1.0 mg/mL时，抑菌效果最好。

由表6可知，在三种中草药单个浓度进行实验时，1.0 mg/mL苦参和0.3 mg/mL大黄的抑菌圈分别为5.5和6.5 mm，抑菌圈均较小，几乎没有抑菌效果，1.0 mg/mL五倍子抑菌圈为17.0 mm，抑菌效果明显，组合X的抑菌圈大小为19.5 mm，抑菌效果最为明显。

通过对比发现，在单方中草药中，大黄、苦参几乎没有抑菌效果，单方五倍子对水霉孢子有一定的抑菌效果，但是单方五倍子抑菌圈小于三种中草药复方的抑菌圈。在10组不同配比试验中，对比发现，组合IV(苦参1 mg/mL+大黄0.5 mg/mL+五倍子0.5 mg/mL)中，最大抑菌圈直径为20 mm，平均抑菌圈直径为19.5 mm，对水霉菌的抑制效果最好。在组合X(苦参1 mg/mL+大黄0.3 mg/mL+五倍子0.3 mg/mL)中，抑菌圈直径为19.5 mm，经过数据查验，可以判定两者在治疗效果方面基本一致。

4 结论

通过正实验和验证试验表明，配比组合比单方的抑菌效果要好。在10组不同的组合中，组合IV和组合X对水霉孢子的抑菌效果均比较好，但是组合X在药量使用上低于组合IV，可以节约成本，降低药液对鱼类的伤害和刺激，因此结合实际情况考虑，组合X的配方更适于实际生产。

中草药治疗水霉病具有诸多优势，其不仅可以杀菌抑菌，还能够调节水体环境，提高水产动物的免疫力。此外，人们越来越关注水产品的质量安全问题，中草药以其药物残留低，成本低，效果好的优势，将会在未来水产养殖业中发挥越来越大的作用。本实验选择三种中草药进行配比研究，选择出最佳配方，希望能够在水霉病防治上发挥一定的作用。