响应面法优化蛋白核小球藻的生长条件

钟晓璇，颜菲菲，曲 奕，陈钰涵，李新颜，邱振鲁

(齐鲁理工学院 化学与生物工程学院，山东 济南 250200)

在自然界的水域生态系统中，藻类是水域食物链的初级生产者，它们的生命活动，能影响和改变水的理化性质[1]。藻类的生长状况往往能指示水体富营养化程度，在富营养化的水体中，藻类及浮游生物大量繁殖，水体溶解氧量降低，水质恶化[2]。富营养化已经成为我国湖泊所面临的主要生态环境问题之一。小球藻是一种淡水湖泊中常见的藻类，并且作为渔业生产常用藻，因其强大的光合作用和易于消化的特性，在鱼、虾、蟹、贝的养殖过程中起着很好的肥水和调水的作用[3]。小球藻富含蛋白质、维生素、生物多糖、不饱和脂肪酸、叶绿素、类胡萝卜素等，已被利用作为鱼、虾、蟹良好的开口饵料，研究表明小球藻对营养物质具有较强的吸收能力，并且能够降解水中氨氮、硫化氢亚硝酸盐等有毒害物质，对改善水质起着重要作用[4-5]。但同时也要注意小球藻的添加量，如果添加过多会导致水体富营养化，导致鱼类大量死亡，对渔业造成损失。研究并控制其生长条件，既可以为通过小球藻生长状况监测湖泊、池塘、鱼缸的富营养化程度提供依据，也可以为开发利用小球藻资源，给养殖鱼类提供更多高营养价值的饵料提供可依靠的参考[6]。

关于小球藻生长条件的研究，已见较多报道，例如陈家长[7]等报道了pH对鱼腥藻和普通小球藻竞争的影响，表明pH 9.0为两种藻类生长的最适pH。徐慧等[8]研究了光照强度对小球藻生长的影响，其研究结果为5 500 lx光照强度是小球藻生长最适光强。然而黄亮[9]的研究报告了小球藻在500 lx和1 000 lx光强下最终都能达到最大生物量，差异并不大。这与徐慧等报道结论不符，可能是由于二者的研究范围一个在低强度光照范围，一个在高强度光照范围所造成的。

影响藻类生长的因素很多，除了环境因素外还有各种操作条件，可变因素较多[10-12]。因此，微生物培养条件的优化工作就显得非常重要。响应面法(Response Surface Method) 即响应曲面设计方法，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。该方法试验次数少、周期短，能够研究几个因素间交互作用，求得的因素与响应值间二次回归方程精确度高，是优化工艺条件、降低生产成本、解决科学研究和生产过程中实际问题的一种有效办法[13]。目前还未见关于小球藻生长条件的响应面法设计优化的相关报道。

本实验选取温度、pH、磷酸盐浓度三个因素，通过响应面法研究它们之间的交互作用对小球藻生长的影响，并通过软件优化小球藻生物量最佳生长条件，以期为小球藻用于水体富营养化的监测及小球藻资源的充分利用提供可靠的数据参考。同时也希望为进一步研究水体中各种藻类的群落结构提供一些初步的材料。

1 材料与方法

1.1 主要实验器材

高压蒸汽灭菌锅；超净工作台；752型分光光度计；恒温摇床；光照培养箱；各种玻璃仪器。

1.2 材料

1.2.1 藻种 蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻。

1.2.2 培养基 M-11培养基：NaNO3100 mg/L；K2HPO410 mg/L；MgSO4·7H2O 75 mg/L；Na2CO320 mg/L；柠檬酸铁6 mg/L；EDTA-Na2·2H2O 1 mg/L；CaCl2·2H2O 40 mg/L；pH 8.0[4]。

灭菌条件：所有培养基经121℃，灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 光照培养 将小球藻接种于M-11培养基中，30 ℃、100 r/min摇床振荡培养12 h制成接种液，取1 mL接种液接种到响应面法设计的不同条件的培养基中，按照设置条件，在光照培养箱中培养，光强度设置为5 500 lx，调整各培养瓶位置使每瓶接受的光强度相同，每个条件培养3瓶，测定数据取平均值

1.3.2 优化实验 实验使用Expert 8.0.6的Box-Behnken Design法进行设计，选取温度、pH、磷浓度作为响应面实验的考察因素(自变量)，以+1、0、-1分别表示自变量的高、中、低水平，以培养48 h后培养液OD680作为响应值。

表1 实验设计因素水平

1.3.3 藻类生物量的测定 藻类生长量的测定采用分光光度法，以A680计。

2 结果与分析

2.1 二次回归模型拟合及方差分析

按照1.3.2实验设计进行实验，结果见表2。

表2 实验设计与结果

利用DesignExpert分析软件对表2中的实验数据进行多元拟合分析，得到蛋白核小球藻生物量(Y) 对温度A、pH值B以及磷酸盐含量C的二次多项回归方程模型为:

Y=0.11+5.708×10-3×A+4.812×10-3×B+1.146×10-3×C+0.012×A×B-2.042×10-3×A×C-3.250×10-3×B×C-0.013×A2-0.033×B2-0.017×C2

回归方程中回归系数的估计值见表3，回归方程的方差分析及模型可信度分析结果见表4-表6。

表3 系数估计

表5 模型可信度分析

由表3、表4可知，模型(P<0.01)具有显著性，模型选择正确。

表4 回归方程的方差分析

注：P<0.01表示影响极显著，P<0.05表示影响显著。

2.2 响应面与最佳发酵条件确定

根据回归方程，及响应曲面图，考察所拟合响应曲面的形状，分析温度、pH、碳氮比对生物量的影响。响应曲面立体分析图及其等高线图见图1-图3。

图1 响应面立体分析图及相应等高图

由图1可见，2个因素交互项显著。pH不变时，随温度的升高，小球藻生物量有增加趋势，当培养温度超过25 ℃时，小球藻生物量降低。温度在24～25 ℃，pH在7.0左右，小球藻生物量较多高。温度对小球藻生长发育的影响很大，藻类的最适宜温度在25 ℃左右。与郭艳琴[9]的研究结论相符。其研究表明，藻类在高于30 ℃和低于4 ℃下几乎不生长，在15 ℃～25 ℃下，均具有明显的指数生长期，随着温度的升高，藻类比增殖速率增大，25 ℃更适合藻类的生长、繁殖。

图2 响应面立体分析图及相应等高图

由图2可见，2个因素的交互项不显著。温度不变时，随磷酸盐浓度的增加，小球藻生物量呈先降低后升高。温度在25 ℃，磷酸盐浓度5.5 mg/L附近时，生物量较高。

图3 响应面立体分析图及相应等高图

由图3可见，2个因素的交互项不显著。磷酸盐浓度不变时，随pH的增加，藻类生物量先升高后降低，当pH超过7.0时，小球藻生物量呈逐步降低趋势。pH过高或过低均会对藻类生长及性能的发挥产生影响。pH为中性条件最有利于藻类生长及性能的发挥。

从图中及软件分析，回归方程存在稳定点，稳定点是极大值点，即温度26.43 ℃、pH为7.25、磷酸盐浓度5.51 mg/L时，此时小球藻生物量最高，达到0.115。考虑到实际操作的条件，将小球藻最佳生长条件修正为26.4 ℃、pH为7.25、磷酸盐浓度为5.50 mg/L。

2.3 验证实验

将藻类接种于M-11培养基中，使用修正后的优化条件培养48 h，小球藻平均生物量达到了0.116，与软件预测值无显著差别，但比优化前的最佳条件略有提高。

3 结论

研究用响应面法优化小球藻生长的最佳工艺条件，建立的小球藻生物量的二次多项数学模型具有显著性，其校正决定系数R2=0.9598，优化后藻类生长的最佳工艺条件为温度26.4 ℃、pH为7.25、磷酸盐浓度为5.50 mg/L，经验证试验检测，生物量由0.114提高到了0.116，与预测值无显著差别。因此响应面法优化得到的结果准确可靠，具有一定的实用意义。