成体干细胞治疗皮肤损伤性疾病的研究进展▲

陈 涛 冯高科 易 欣 蒋学俊

(武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所、心血管病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：1275793102@qq.com)

【提要】 干细胞是一类具有自我更新、分化能力的多潜能细胞。近年来，成体干细胞在皮肤创伤治疗中的应用备受关注，主要用于治疗糖尿病皮肤溃疡、静脉溃疡、遗传性皮肤病等。本文就成体干细胞在皮肤损伤性疾病中的研究进展进行综述。

皮肤是全身最大的器官，也是最容易损伤的器官，其在热失调、抵抗机械力和感染等方面发挥重要作用。多种原因可导致皮肤伤口愈合延迟，其中糖尿病皮肤溃疡、静脉溃疡、部分遗传性皮肤病等难愈性创伤仍缺乏有效的治疗手段[1-2]。干细胞是一类具有自我更新、分化能力的多潜能细胞[3]。近年来，干细胞在皮肤创伤治疗中的应用备受关注。用于损伤皮肤组织修复和再生的干细胞主要是胚胎干细胞和成体干细胞(somatic stem cell，SSC)两大类[4]。胚胎干细胞虽然存在自我更新能力，但其来源不足且伦理问题突出[5]，因此，研究者们逐渐将研究重点转向SSC。SSC主要包括表皮干细胞(epidermal stem cell，ESC)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)、脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ADSC)、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和造血干细胞等[4]。本文就SSC在皮肤损伤性疾病中的研究进展进行综述。

1 ESC

皮肤表皮细胞的持续更新和损伤后再生修复能力取决于表皮基底层的ESC，ESC是表皮增殖单元的核心[6]。哺乳动物皮肤表皮由滤泡间细胞和相关附件(毛囊、皮脂腺和汗腺)组成，每个部位都有相应的干细胞群[7-8]。当皮肤受损时，与其相邻的未受损毛囊或皮脂腺中的干细胞发生迁移，对损伤皮肤进行修复，而影响干细胞迁移的因素均可间接影响皮肤损伤的修复[9]。皮肤伤口愈合的主要阶段包括炎症、增殖、再上皮化、血管生成、重塑和瘢痕形成等[1]。研究发现，在前缘角化细胞上表达的新整合素以及肌动蛋白交联因子7在促进细胞黏附、细胞迁移中发挥重要作用[10]。Alcolea等[6]研究表明，创面边缘的趋化因子基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)水平明显升高，ESC表达并促进基质细胞衍生因子受体4(CXC趋化因子受体4，CXC chemokine receptor type 4，CXCR-4)增殖，阻断SDF-1/CXCR-4通路后，表达SDF-1的ESC明显减少，导致伤口愈合延迟，而外用SDF-1可促进伤口愈合。

目前ESC的临床应用主要体现在自体表皮培养移植术(cultured epidermal autograft，CEA)。与传统的自体皮肤移植相比，CEA使用的移植物主要是从自体皮肤组织中分离并在体外生物材料上培育的表皮移植体，这些分离培养物中富含ESC，可以解决自体供皮不足的问题，避免二次创口形成[11-12]。Kadoya等[13]对不同程度烧伤患者进行烧伤瘢痕切除和CEA，结果显示皮肤伤口可持续愈合且正常表皮化。Akita等[14]对大面积烧伤患者进行高度扩张的皮肤移植辅以CEA治疗，术后6个月和12个月时患者扩张的皮肤移植可以最大限度地减少供体需求和瘢痕形成。然而，CEA在体外需要较长的培育时间，且对培养设备要求高，成本昂贵。此外，接受CEA治疗的患者感染风险更高，严重时可导致移植失败。其原因主要是CEA移植物灌注不足，因此，如何加强创面血液灌注和增强患者免疫力仍有待进一步研究[12]。

2 BMSC

间充质干细胞在体内和体外均具备分化潜能，是治疗皮肤损伤的重要细胞[15-16]。最早发现的间充质干细胞来源于骨髓组织，BMSC易于获取和培养，具有多向分化潜能，免疫原性低，是目前皮肤创伤修复中主要的异体细胞种类[17]。

Fang等[18]研究发现，BMSC通过旁分泌信号通路抑制增生性瘢痕成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和迁移，降低增生性瘢痕成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子β1、转化生长因子β2的表达水平，使抗纤维化因子如转化生长因子β3和蛋白核心聚糖的表达显著增强，从而抑制纤维化进程。Zheng等[19]研究发现，BMSC可以分泌转化生长因子β1、SDF-1和前列腺素E2，抑制炎症反应，增加细胞趋化性与增殖能力，抑制纤维化及瘢痕形成，从而治疗辐射诱导的急性皮肤损伤。BMSC和破骨细胞是转化生长因子b超家族成员激活素的主要来源，激活素B为激活素的主要形式之一，BMSC表面高度表达激活素B受体，激活素B可诱导BMSC内肌动蛋白应激纤维的形成，并通过c-Jun氨基末端激酶细胞外信号调节激酶信号通路调控细胞迁移，从而促进伤口愈合，减少纤维瘢痕的形成[20]。

单纯将BMSC注射入皮肤受损区域无法克服灌注不足、瘢痕形成等问题，而将分离培养后的BMSC种植到三维凝胶海绵支架上，可以促进血管生成，减少组织空洞形成，从而提高移植疗效[21]。通过基因工程技术将载有人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165和人-防御素3基因的质粒转染入大鼠BMSC，可促进其旁分泌作用，缩短伤口愈合时间，减少肉芽组织的形成与胶原的沉积，说明该疗法在治疗放射性创伤等难治性创面中具有良好的应用前景[22]。

3 ADSC

ADSC除了能够分化成为内皮细胞和血管细胞，具有促进血管新生的潜力外，还能够通过旁分泌功能加速伤口愈合[24]。因此，近十年来ADSC在促进伤口愈合中的潜在作用备受关注。

ADSC具有与BMSC类似的分泌特性，能够从脂肪组织中通过低侵入性操作大量获取，每克皮下脂肪组织中间充质干细胞的含量是骨髓的500倍[25-26]。外泌体是ADSC重要的旁分泌因子之一，在皮肤损伤愈合过程中，ADSC来源的外泌体通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路促进成纤维细胞增殖和迁移，优化胶原沉积，进一步加速损伤愈合[27]。体外培育的ADSC可表达脂联素和瘦素[28]，与人真皮成纤维细胞相互结合，显著增加透明质酸和胶原蛋白的生成，促进皮肤伤口愈合[29]。缺氧条件下体外培养的ADSC能显著促进人真皮成纤维细胞的胶原合成和迁移，与正常氧条件下体外培养相比，缺氧条件下培养的ADSC可明显减少伤口面积，促进VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等生长因子的表达，促进血管生成，使用中和抗体抑制VEGF和bFGF可抑制人真皮成纤维细胞的迁移和皮肤伤口愈合[30-31]。临床上在自体富血小板血浆中培养ADSC有助于移植后脂肪细胞的增殖和ADSC的分化，能促进大量生长因子生成如VEGF、血小板源性生长因子、表皮生长因子等[26]表达。

目前利用ADSC治疗皮肤相关疾病的安全性、持久性仍有待进一步研究，如ADSC作为可溶性因子分泌载体的具体作用机制、供体年龄是否影响ADSC的潜力等，不断对ADSC在皮肤再生和创伤愈合中的功能机制进行深入研究，对于寻找治疗皮肤损伤疾病新靶点具有很大前景。

4 人羊膜上皮细胞

人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell，hAEC)是围生期产生的具有胚胎干细胞样分化能力和SSC样免疫调节功能的干细胞之一，可促进伤口愈合[32]。Zheng等[33]在糖尿病小鼠全层切除性皮肤伤口周围皮下注射hAEC，结果显示hAEC可分泌白介素13等促进巨噬细胞向M2表型转化，促进内皮细胞迁移和增殖，增加损伤区域毛细血管密度。Zhao等[34]研究发现，hAEC可通过激活细胞外信号调节激酶、c-Jun氨基末端激酶和蛋白激酶B信号通路调节角质形成细胞的迁移和增殖，进而促进伤口愈合；此外，与hAEC共培养的角质形成细胞可上调细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3和双微体2癌基因的表达，通过激活有丝分裂加速组织的修复过程。体外伤口局部注射hAEC可以促进成纤维细胞的迁移和增殖，促进金属蛋白酶1的表达，抑制以Ⅰ型胶原蛋白Ⅰ、Ⅰ型胶原蛋白Ⅲ为主的细胞外基质生成，加速皮肤伤口愈合并抑制瘢痕形成[32]。与ADSC的旁分泌作用相比，hAEC分泌表皮生长因子、血小板源性生长因子B等生长因子的水平更高，提示hAEC可能具有比ADSC更显著的治疗皮肤损伤效果[35]。Zou等[36]研究发现，与干细胞多能性相关的转录因子Oct4、泛素连接酶2和Nanog基因的表达水平随体外培养的传代次数增加而降低，泛素连接酶2可能被激活并与Oct4蛋白结合，从而引发泛素化和降解，导致Oct4蛋白表达缺失和干细胞多能性降低；microRNA-32通过抑制泛素连接酶2的表达，抑制泛素化和凋亡，从而维持体外hAEC培养物中干细胞多能性。因此，hAEC具有干细胞样可塑性和双重免疫调节特性，易大量获取，遗传稳定，且不涉及医学伦理问题，是干细胞的理想替代来源，将成为临床治疗糖尿病基础伤口和其他慢性创伤的有效方法[5，32]。

5 诱导性多能干细胞

随着对干细胞的进一步研究，通过将体细胞与四种转录因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或Oct4/Sox2/Nanog/Lin28)结合，可以诱导体细胞向诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)转化，使得iPSC成为再生医学研究和细胞治疗中最普遍和易获得的细胞来源[37]。在糖尿病溃疡小鼠模型的皮肤损伤研究中，iPSC源性外泌体可以直接作用于细胞，促进糖尿病小鼠皮肤成纤维细胞迁移和增殖，并增加血管密度[38]。此外，iPSC容易进行基因改造，因此在治疗遗传性皮肤病方面具有广泛的应用前景。分离患者皮肤细胞进行基因重组使之转化为iPSC，并对同源重组获得的iPSC突变进行修复，诱导其分化为所需的细胞类型，最后进行自体移植可达到治疗效果[39]。隐性遗传营养不良型大疱性表皮松解症是一种编码Ⅶ型胶原的COL7A1基因突变引起的遗传性水疱性疾病，Itoh等[40]从该类患者皮肤中成功分离出纤维细胞，证明自体iPSC有潜力为遗传性皮肤病的再生治疗提供细胞来源；然而，通过iPSC矫正COL7A1基因潜在的遗传缺陷是否适用于该病所有患者，还需进一步验证。

iPSC治疗皮肤相关疾病还存在一定的局限性，比如现有的细胞纯化技术尚不能完全成功地将分化细胞从未分化的iPSC中分离出来，而未分化的iPSC移植后会增加肿瘤或畸胎瘤形成的风险；还有基因重编效率低，重编过程对细胞基因组完整性的影响程度尚不清楚，iPSC可能会导致基因组异常等[39]。因此，iPSC真正用于临床治疗还有待进一步深入研究。

6 总 结

综上所述，进一步研究各类干细胞参与皮肤损伤愈合修复以及恢复受干扰的皮肤稳态的作用机制，对寻找更确切有效、广泛适用的皮肤损伤治疗策略具有十分重要的意义。针对慢性伤口及瘢痕伤口等难愈合伤口的治疗，分离纯化各类干细胞并进行鉴定，优化体外培育干细胞方案，以及设计更优的培育支架载体和降低临床应用成本，均是未来研究的重点。