氨基酸纸色谱层析法实验条件优化的探索

刘颖沙， 刘小宁， 李国秀， 刘 伟， 时 静， 孙 进， 钟 阳

(杨凌职业技术学院， 陕西 杨凌 712100)

纸色谱法是以滤纸为支持物的层析技术，滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此与水亲和力强，与有机溶剂亲和力弱，所以在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相，由于溶质在两相中分配系数不同，不同的氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不同的色谱点，各物质分配系数相差越大，则越容易分开。样品被分离后在纸色谱图谱上的位置，常用比移值Rf(Rf=原点到色谱点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离)表示，在一定条件下(如温度、展开剂的组成、色谱纸质量等不变)，某物质的Rf是定值，可作为定性分析的依据。纸色谱分离技术广泛应用于氨基酸、蛋白质、染料、色素和中草药等物质的分离和鉴定，其操作简便，样品用量小，既可以用作实验室的定性分离，也可用于工业生产产品的分析制备，现已成为生物化学和生物工程等学科必不可少的分析工具之一。在农产品质量检测专业的《食品生物化学》课程中“氨基酸的纸色谱”是学生重要的实验实训内容[1]，但是如果按照课本步骤操作：首先，耗时过长，无法在4学时内完成实验；其次，用微量注射器或者毛细管进行点样的方式受人为因素干扰，组间结果差异较大；第三，滤纸易受污染，用滤纸作为惰性支持物容易影响最后分离效果；第四，展开剂展开速度较慢且有刺激性气味；第五，用喷雾器喷显色剂(茚三酮溶液)，喷出量和均匀性无法把握，容易污染学生的实训服。为改善实验方法，本文对“氨基酸的纸色谱”实验的固定相、展开剂、点样方式和显色方式进行优化[2-6]。

1 材料与方法

1.1 材料

色谱滤纸(新华一号滤纸)、薄层板、剪刀、层析缸(烧杯500 mL)、培养皿、吹风机、微量注射器(5 uL)或毛细管、移液枪(5uL)、喷雾器、尺子和铅笔、镊子、封口膜。

1.2 试剂

(1)0.5%的氨基酸溶液(亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸)，各种试剂均为分析纯。

(2)展开剂(100 mL)。

1号：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；

2号：V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2；

3号：V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(乙醇)：V(水)=4∶1∶1∶2；

4号：V(95%乙醇)：V(水)=7∶3。

1.3 显色方式

传统方法，展开完成之后用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮溶液进行显色；改进方法,100 mg茚三酮加入配置好的展开剂。

2 实验步骤

2.1 点样方式与展开剂的优化[7，8]

(1)滤纸。取滤纸1张(22×14 cm)。

(2)点样。距一端2 cm处用铅笔轻轻的划线，然后在线上分别用0.5%的亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和缬氨酸均匀点样(微量注射器5uL、毛细管、移液枪5 uL)，重复3次，每次点样完后用吹风机冷风吹干，每点扩散直径不超过5 mm。将点好样的滤纸卷成筒状，使用大头针缝好(按课本操作步骤用针线缝，常常扯烂滤纸，影响实验结果)。

(3)展开[9]。将盛有20 mL展开剂的培养皿迅速置于500 mL的烧杯中，并将点样筒直立于培养皿中(点样端在下)，用封口膜封紧烧杯口，待溶液上升至15～18 cm时，取出滤纸，用铅笔画出溶剂前沿界线，吹风机冷风吹干。

(4)显色。用喷雾器均匀喷涂0.1%茚三酮溶液(展开剂1、2、3所配茚三酮以正丁醇做溶剂，展开剂4所配茚三酮以乙醇做溶剂)，立即用热风吹风机吹干，即可出现不同位置和颜色的斑点。

(5)Rf值计算。

Rf=原点到色谱点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

2.2 固定相的优化[10,11]

(1)薄层板。取薄层板1张(22×14 cm)。

(2)点样。按照2.1优化的最佳点样方式进行点样。

(3)展开与显色。在(500 mL)的烧杯中倒入1 cm的展开层，用镊子将点好样的薄层板放入烧杯中，点样端在下，用封口膜封紧烧杯口，待溶液上升至15～18 cm时，取出薄层板。其余步骤与2.1一致。

2.3 显色方式的优化[12,13]

(1)滤纸或薄层板准备和点样方式按照2.1和2.2优化的步骤。

(2)展开与显色。展开剂为100 mg茚三酮混合4种展开剂，将点样筒或板放入展开剂中，用封口膜封紧烧杯口，待溶液上升至15～18 cm时，取出滤纸，用铅笔标记溶剂前沿，吹风机热风吹干。即可出现不同位置和颜色的斑点，用铅笔描出斑点轮廓。根据Rf值公式计算各样品的Rf值。

3 结果与分析[14,15]

3.1 点样方式优化结果分析

用微量注射器、毛细管和移液枪分别点样现象，以传统方法进行分离(固定相：滤纸；流动相：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；显色：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液)，微量注射器和毛细管易戳破滤纸而且点样圈不均匀，不易操作，移液枪点样5uL量易于控制且点样圈大小一致，故采用移液枪进行点样操作。

3.2 固定相优化及展开剂优化结果分析

以滤纸和薄层板固定相载体，以四种不同展开剂为流动相，对4种不同类型的氨基酸进行分离，两种固定相及四种不同展开剂均能达到明显分离效果，实验结果如表1所示。

由表1可知，采用薄层板进行层析分离效果优于滤纸。Rf值表示溶质在支持物上移动的速率，影响Rf值因素很多，主要受物质的结构和极性、支持物、层析所用溶剂、温度、展开方式、pH及样品溶液中杂质的影响[5]，在进行氨基酸分离鉴定时薄层色谱层析法比纸色谱层析法更具有速度快、斑点集中和显色灵敏等优点。

四种不同类型的展开剂均能达到分离目的。结合分离效果、时间和试剂毒性，2号展开剂(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)分离效果较好、分离时间较短且毒性较低； 4号展开剂乙醇易挥发使展开剂浓度不准确，展开时间较长，而且展开剂需要临时配制导致实验准备工作繁琐，故不宜采用。

因此，以薄层板做固定相，以2号展开剂(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流动相，采用移液枪进行点样操作分离效果最佳。

3.3 显色方式优化结果分析

以薄层板做固定相，采用移液枪进行点样操作，展开剂为100 mg茚三酮混合4种展开剂，对4种不同类型的氨基酸进行分离，结果如表2所示。

由表2可知，采用100 mg茚三酮混合2号展开剂(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流动相，作为新展开剂进行分离，分离速度快，效果明显，显色灵敏，实验时间明显缩短。综上所述，将茚三酮加入用V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2的展开剂中做流动相，以薄层板做固定相，移液枪点样，实验过程不需要接触有毒试剂，实验时间缩短，实验结果明显。达到预期目的。

表1 滤纸和薄层色谱层析实验结果对比

表2 薄层色谱层析优化结果